细胞中蛋白质含量可反映细胞生长增殖的状况，从而反映药物对细胞的毒性作用。用考马斯亮蓝（Coomassie brilliant blue）法测定蛋白质含量，是利用蛋白质与染料结合的原理，定量测定微量蛋白质浓度。测定时，先将细胞溶解释放蛋白质，再加入游离状态的考马斯亮蓝G-250，考马斯亮蓝G-250溶液在酸性溶液中呈红褐色，与蛋白质结合后呈现蓝色。在一定的浓度范围内，蛋白质含量与颜色的深度成正比，通过比色并与标准蛋白质比较可以得出蛋白质的浓度，因而可以计算出细胞中蛋白质的含量。

考马斯亮蓝法的突出优点是：灵敏度高，最低蛋白质检测量可达lmg；测定快速、简便，只需加一种试剂；干扰物质少。

【材料】

1. 96孔培养板培养的待测细胞与对照组细胞。

2. 0.5mo1/L NaOH。

3．生理盐水。

4．蛋白质标准溶液：称取10mg牛血清清蛋白，溶于蒸馏水并定容至l00ml，制成l00pg/ml的原液。

5．考马斯亮蓝G-250蛋白试剂。称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml 90％乙醇中，加入85% (m/v）的磷酸l00ml，最后用蒸馏水定容到1000m1。此溶液在常温下可放置一个月。

6．器具试管、吸管；分析天平、离心机；可见分光光度计。

【方法】

1．标准蛋白质曲线的绘制。取7支小试管，按表13-1要求进行操作。

混匀后静置5分钟，以1号为空白，595nm处比色。以各管光密度值为纵坐标，以各管蛋白质浓度为横坐标，绘成标准曲线。

2．蛋白质含量测定。吸取培养板各孔培养液，加入与培养液等量的生理盐水洗涤，弃去生理盐水，然后加入等量的0.5mol/L NaOH，以使细胞释放蛋白质，然后按表13-2进行操作。

混匀后静置5分钟，以对照管为空白，595nm处比色。根据标准曲线确定样品中蛋白质浓度。

【结果与分析】

根据所测样品的吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量（ug)，按公式13-1计算：
每培养孔蛋白质含量（微克／孔）=测定的蛋白质浓度（ug/ml)x每孔加入的0.5mo1/L NaOH的体积（ml)x稀释的倍数（公式13-1）药物的细胞毒性越大，每培养孔中蛋白质含量越低。

【注意事项】

1．测定的各管光密度值若太高，应对待测液进行稀释。

2．在试剂加入后的5～20分钟内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。

3.测定中，蛋白一染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。

4．由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时也可选用g-球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。

5．有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。

除了考马斯亮蓝法，常用的蛋白质检测方法还有Lowry法（福林-酚试剂法）和BCA法（二喹啉甲酸法）。Lowry法的显色原理是：在碱性条件下蛋白质与铜作用生成蛋白质一铜复合物，该复合物随之将磷钼酸一磷钨酸还原成蓝色复合物。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质量成正比，蛋白质浓度范围约在25～250 ug/ml。虽然该法是测定蛋白质浓度应用最广泛的方法之一，但其专一性较差，干扰物质多（如Tris缓冲剂、蔗糖、硫酸铵、琉基化物、酚类、枸橼酸等），标准曲线的直线关系不特别严格。BCA法是Lowry测定法的一种改进方法，是近来广为应用的蛋白定量方法。其原理与Lowery法蛋白定量相似，即在碱性条件下蛋白质分子中的肽键能与Cu²⁺络合生成络合物，同时将Cu²⁺还原成cu⁺。二喹啉甲酸及其钠盐是一种溶于水的化合物，在碱性条件下，可以和Cu⁺结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562nm处有高的光吸收值，并且化合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。与Lowery法相比，BCA蛋白测定方法操作更简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性更好，几乎没有干扰物质的影响，灵敏度高（微量检测可达到0.5 ug/ml)，应用更加灵活。与Bradford法相比，BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。BCA法与Lowry法都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。