再生障碍性贫血（aplastic anemia, AA）是一种骨髓造血功能衰竭症而引起的骨髓造血功能低下性疾病，主要表现为全血细胞减少和贫血、出血、感染等。目前认为T淋巴细胞功能亢进在再生障碍性贫血发病机制中占重要地位，再生障碍性贫血是T淋巴细胞介导的以造血系统为靶器官的自身免疫性疾病。异基因造血干细胞移植是治疗再生障碍性贫血的有效方法之一。

【材料】

1．组织来源异体的骨髓、外周血及脐血。

2．造血干细胞采集、分离用试剂生理盐水、肝素、Ficoll-hypaque分离液、葡萄糖酸钙。

3．实验器材骨髓穿刺针或多功能细胞单采仪，低温离心机，倒置显微镜，净化工作台，流式细胞仪，荧光显微镜，热合仪，洁净服，一次性注射器，一次性无菌纸巾，无菌口罩，无菌帽子，无菌手套等。

【方法】

1．取材：

(1)骨髓造血干细胞采集：硬膜外麻醉或用1％的利多卡因分别在双侧的骼骨棘部位作局部麻醉。然后用骨穿针进行多点穿刺。用已抽取5 ml肝素盐水的50ml注射器，抽取骨髓血。抽取时要尽可能多地抽取蜂窝状骨间隙中的骨髓血。将抽出的骨髓血缓慢贴壁注入无菌瓶中，同时不断晃动以使肝素与骨髓血混匀，避免凝血。抽取300～400m1左右的骨髓血（单独异基因骨髓移植所需要有核细胞应达到3x10⁸/kg以上）。穿刺点压迫止血3～5分钟，包扎穿刺点，将供者送入病房观察。

(2）外周血造血干细胞采集

1)造血干细胞动员：造血干细胞采集前，供者先采用G-CSF进行造血干细胞动员，剂量为G-CSF4～6mg/kg。动员后的第5～7天进行外周血造血干细胞采集。

2）细胞分离机采集造血干细胞：首先将细胞分离机设定为淋巴细胞分离程序，然后对细胞供者进行静脉穿刺，建立两条静脉通路，一条用于将血液导入分离机分离，另一条用于将分离后的剩余血液成分导回静脉。细胞分离机处理血容量值设定为8000～10000m1，启动细胞分离机，全血流速30～50ml/min。在采集过程中适量注射葡萄糖酸钙。采集持续时间2～3小时，其间医护人员需要注意观察供者的心率、血压以及是否出现过敏性皮疹。

(3）脐带血的采集：新生儿出生后，在近婴儿与近母体端分别用两把止血钳结扎脐带，剪断脐带。抱走新生儿后，在近母端止血钳处消毒脐带并将针头插入，采集脐血。

2．细胞分离HLA配型与ABO血型均相合供者的造血干细胞采集液可直接用于移植，不需要分离细胞。而对于供、受者HLA配型相合而ABO血型主副交叉反应不相合时，采集的造血干细胞应做去除红细胞与血浆处理，以免出现溶血反应。

3．细胞鉴定人造血干细胞以CD34⁺, CD38^-及HLA-DR-为表型特征，可采用流式细胞仪对人造血干细胞进行鉴定。

4．临床应用

（1)受者预处理：

1)年龄＜30岁患者的预处理：环磷酰胺50mg/(kg·d)，处理4天（移植前第5至移植前第2天）和抗胸腺细胞球蛋白2.5mg/kg·d，处理3天，甲泼尼龙2 mg/kg·d，处理3天（移植前第5至移植前第3天）。

2）年龄＞30岁患者的预处理：宜采用低强度的预处理，通常采用环磷酰胺1200mg/m²、氟达拉滨120mg/m²联合ATG或抗CD52单抗。

(2)造血干细胞移植：造血干细胞可通过中心静脉输注，输注前需要静脉注射地塞米松5mg。

【结果】

移植成功后受者中性粒细胞在9～24天左右增加至0.5x10⁹/L，血小板在14～26天左右增加至20x10⁹个／L以上。

【注意要点】

1．移植的造血干细胞数量对治疗效果有极大的影响，移植细胞数量不能少于3x10⁸单个核细胞／千克体重、CD34⁺细胞不能少于3x10⁶个／千克体重。

2．供、受者性别一致性对患者的生存率有较大影响，供、受者性别一致，受者的生存率明显提高。

3．供、受者间的HLA匹配程度及ABO血型的差异等都会影响移植的效果。供者选择顺序为：①HLA全相合的同卵双生同胞；② HLA全相合、ABO血型相同的异基因同胞；③HLA全相合、ABO血型相同的非亲缘供者。

4．外周血造血干细胞移植后的中性粒细胞及血小板数量恢复较快，但慢性GVHD发生率较高，生存率较低。骨髓中除含有造血功能恢复所需要的造血干细胞而外，还具有造血微环境所必需的基质细胞等成分，是再生障碍性贫血治疗的理想干细胞源。