血管一般可分为内膜、中膜和外膜三层，平滑肌细胞是中膜的主要细胞成分。在AS和血管重建术后再梗死的主要病理基础中，血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell,VSMC)的移行和过度增殖起着极其重要的作用。每当血管内皮细胞受损时，单核细胞和血小板黏附并分泌细胞生长因子，可刺激VSMC移行与增生，已知不少物质具有这类作用。很多学者认为VSMC是AS发病学的主要实质细胞，在阐明AS的病因及发病机制中有很重要的地位。抑制VSMC移行和增生的物质，可抑制AS病变形成和血管成形术后再梗死。VSMC体外培养方法的建立，有助于了解其分化、生长及其在血管性疾病中的作用及药物对VSMC的直接影响。

取动物或人血管的中膜进行分离，在合适的环境下能使VSMC进行生长和传代。常用家兔、大鼠、牛、猪、羊及流产胎儿主动脉、肺动脉及脑动脉。培养方法根据实验要求选取。在相同条件下观察细胞生长密度，DNA合成，可观察药物对VSMC生长的影响。

【材料】

1．兔、大鼠、猪、牛、猴、人胚、胎儿和成人的血管，均可用于平滑肌细胞培养。取材部位以胸主动脉、降主动脉、肺血管、脑血管、脐血管和肠系膜血管最常用。其中以兔主动脉最常用。

2．胰蛋白酶、小牛血清、培养基、结晶紫、M1T,³H-TdR药盒。

3．仪器与试剂净化工作台、C0₂孵箱、倒置显微镜、液体闪烁计数仪、分光光度计、多孔扫描分光光度计。

【方法】

1．贴壁组织块培养在无菌操作条件下取出所需血管，以Hanks液洗去血污，在盛有Hanks液培养皿中剥离外膜，纵行剪开血管，使内膜朝上平摊于平皿中，以圆钝的镊子或剪刀背轻轻刮去内皮细胞，将剥去外、内膜的动脉中层用培养液洗净。剪去两端夹钳过的组织，以锋利的虹膜剪剪成约1 mm³小块。用弯头种植针或尖嘴镊，将组织块以相互间隔0.5mm左右距离规则排列于培养瓶中或培养皿中，倒置培养瓶或皿，加入含10％～20％小牛血清的培养液，在37℃ C0₂孵箱中静置5～7小时后，轻轻翻转培养瓶，使组织块浸泡在培养液中，放回孵箱继续培养，每3天换液一次，一般4～7天细胞从组织块边缘长出。2～3周出现致密的细胞层，这时取出组织块，使细胞生长至融合。

2．分散细胞原代培养法又称酶解离法无菌条件下，将新鲜的动脉迅速置于含Hanks液的平皿中，仔细清洗并剥去血管表面的纤维、脂肪和多余的血块。将血管移入另一含酶消化液（无Ca²⁺-mg²⁺ Hanks液配制的含有1g/L胶原酶，0.5g/L弹性酶）的平皿中，37℃消化0.5～1.5小时后，用眼科镊仔细剥去外膜及外层中膜，刮除内皮细胞撕下中膜的内2/3，注意不要混入内皮细胞，将组织块切成1～2mm²，移入另一新鲜含酶消化液的平皿中，37℃消化2～3小时并不时振荡，收集细胞悬液并用同法再消化一次剩余的组织块，合并细胞悬液与5倍量含10％小牛血清的培养液混匀于离心管中，1500r/min离心5分钟，收集细胞并重新悬浮于培养液中调整细胞数，然后转入培养瓶或培养皿中培养，接种密度为（1～4)x10⁵/cm²。一般2小时后细胞开始逐渐贴壁，6～8小时全部贴壁，每2～3天换培养液一次，1～2周细胞生长融合成单层细胞时，即可传代培养。

3．微血管平滑肌细胞培养（culture of microvascular smooth muscle cells）大血管和微血管平滑肌细胞的分化及功能较大差别，因此微血管平滑肌细胞的培养近年米亦成为一项重要技术，尤其是在脑血管疾病的研究中。下面以脑血管为例，介绍其微血管平滑肌细胞培养。

无菌条件下，取出大脑半球，置于含有25mmol/L HEPES的Hanks (pH 7.4)液中，剪碎脑组织并匀浆，匀浆液用孔径为210um的尼龙网进行过滤后，将滤网浸于上述液体中且不断摇晃，以使网上含有大量微血管的组织块脱落于液体中，800r/min离心5分钟，将离心所得组织块溶于消化酶(0.125g/L弹性酶,1g/L胶原酶，0.375g/L大豆胰酶抑制剂，0.2mmol/L氯化钙，15mmo1/L HEPES,2g/L牛血清白蛋白，用DMEM配制）中，37℃水浴振荡培养60分钟，用吸管吹打组织悬液，800r/min离心5分钟，收集细胞团块并悬浮于培养基中，分装至培养瓶中，置于37℃ 5% C0₂培养12～18小时，仔细吸去未贴壁细胞和细胞团块，更换新鲜培养液。当细胞形成致密层时，即可传代培养。

当原代细胞生长成片时，即可传代。传代时，倾去培养液，以Hanks液洗涤培养瓶或皿2次，然后以0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA（乙二胺四醋酸二钠）混合液覆盖细胞表面，在室温下作用约2分钟，在倒置显微镜下见到大部分细胞收缩、边缘清楚（约80％细胞成为游离细胞）时即翻转培养瓶停止消化，倾去消化液，加入含10％小牛血清培养液，用吸管轻轻反复轻轻吹打瓶壁，把细胞吹打成悬浮状，800r/min离心5分钟，细胞用新鲜培养液混匀，进行细胞计数。以5x10⁴～5x10⁵/ml密度接种在新培养瓶中，在37℃,5% CO₂孵箱中培养，每3天换液一次，至细胞生长至致密单层时（7～10天），可依法进行第二次传代。

4．实验设计一般传至5～6代，得到数量较大而又均一细胞，进行实验。实验常在96孔或24孔培养板中进行。给药组加入不同浓度药物，预孵一定时间，与对照组比较，观察药物对生长刺激因子的作用。

【结果与分析】

1．细胞鉴定

(1)形态观察：在倒置相差显微镜下，原代和5代以内的平滑肌细胞常呈针形，5代以上的平滑肌细胞其形状增大。当细胞长满瓶底时，典型的平滑肌细胞为梭形或长梭形，平行呈束状排列，亦可重叠生长达多层，密集与稀疏交叉呈“峰”与“谷”状。峰处细胞密集、多层，谷处细胞稀疏，有1～3层细胞甚至没有细胞。这一特点易与成纤维细胞区别，后者可表现为“同心圆”状的生长形式。

(2）免疫荧光检查：大多数情况下，仅靠光镜区别平滑肌细胞、成纤维细胞及内皮细胞是很困难的。利用免疫荧光技术，鉴别分化型平滑肌细胞特有的标记蛋白—肌宁蛋白和a一肌动蛋白是一种非常有用的鉴别方法。

(3）透射电镜观察，可把平滑肌细胞分“合成型”与“收缩型”二型。平滑肌细胞原代培养的最初一周以“收缩型”为主，以后逐渐向“合成型”转化而大量增殖。合成型胞质充满粗面内质网，囊腔扩大，充满蛋白质，核中异染色质较多，但粗或细肌丝很少，肌动蛋白的抗体荧光染色阴性，细胞无收缩功能。“收缩型”细胞是平滑肌细胞的典型表现，主要特征为胞质内有成束状排列的束状肌丝，与细胞长轴平行，肌束之间可见与其相连的致密体。细胞膜附近可见特有的密斑和吞饮小泡，细胞有收缩功能。传代培养细胞最初从“收缩型”转化为“合成型”很快，约6～10天又复原，但已无收缩功能。

2．结晶紫染色法将细胞以一定密度接种在24孔培养板，进行实验试剂处理，实验终止时吸出各孔培养液，以1％戊二醛（溶于Hanks液）1 ml/孔固定15分钟，吸出上清液。以0.1％结晶紫（溶于三重蒸馏水中）1 ml/孔染色30分钟，吸出上清液，以去离子水轻轻洗涤15分钟，吸去上清液，将培养孔在自然条件下晾干，即可在倒置显微镜下进行形态观察及照相。然后每孔加入0.2% Triton X-100溶液1 ml，使细胞内结晶紫溶解，于 595 nm波长处比色进行吸光值测定，以作定量分析。

3. MTT比色法MTT[3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,溴化四氮唑盐]能进入活的线粒体内与各种脱氢酶反应，所以是测定细胞成活及增生的方法。以PBS溶解MTT制成5 mg/ml溶液，抽滤灭菌。按每孔100ul培养液加入10ul的量，把MTT加入细胞培养孔内，在37℃继续培养4小时。取出培养板，吸出孔中培养液，每孔加入100ul酸性异丙醇(0.04ml/L HCl)，使深蓝色（甲攒）结晶彻底溶解。在室温下放置数分钟，确认结晶完全溶解后即把培养板在波长570nm,630nm，校准设在1.99（如样品着色过强，则设在1.00）的多孔扫描分光下读数。在加入异丙醇后1小时内测定完毕。也可以二甲亚砜(DMSO) 320微升／孔代替异丙醇溶解细胞内MTT，在酶联免疫测定仪上于波长570nm或570nm,630nm双波长处测定吸光值并分析。

4. ³H-TdR放免测定待测细胞吸去培养液，每孔加入含，H-TdR培养液200ul（含放射量3.7x10⁴Bq)，在37℃孵育24小时后终止培养。以冷PBS 200ul清洗3次，加入4℃ 10％三氯醋酸200ul，放入4℃冰箱30分钟，吸去三氯醋酸，加入乙醚：乙醇（1：2)混合液200ul漂洗，吸去液体，晾干。加入0.4mo1/L NaOH溶液200微升／孔溶解细胞，在56℃恒温箱中放置2小时，吸出全部液体注入含有5m1闪烁液的闪烁瓶中，加盖摇匀，放置2小时后进行液闪测定。

【注意事项】

1．平滑肌细胞取材广泛，但以年幼动物的血管较易培养成活。血管的新鲜程度也十分重要，新鲜的血管，易于培养成功，取材时迅速将游离的血管置于Hanks液或培养液，并在2小时内进行分离培养。

2．将血管的内、外膜彻底剥离干净是保证培养细胞纯度的关键。剥离时，动作要轻柔，尽量减少组织损伤，弃去已夹过的组织。小牛血清质量与实验关系密切。有条件可加入PDGF等细胞生长因子。游离细胞培养时还应注意胶原酶和弹性酶的纯度，以及酶的活性，以保证分离消化成功。很多培养基可用于平滑肌细胞的培养，如M199, DMEM, RPMI, MEM等。较常用的则是DMEM,M199培养基。

3．不同的培养方法有不同的用途和优缺点，应根据实验要求选择合适的培养方法。在加入药物前，以0.4％小牛血清培养液培养细胞48～72小时，然后改换10％小牛血清培养液，可使细胞对药物敏感性增高。