血一脑脊液屏障的存在使得几乎所有大分子药物和许多小分子药物难以进入中枢神经系统发挥作用，这是新药开发所面临的挑战之一。从早先分离培养微血管上皮细胞，发展到与星形胶质细胞共培养，近年还发展了三维动态模型，体外BBB模型越来越接近体内形态学和功能学特征，能够用于评价药物在BBB的传递特性。但是原代培养的脑微血管内皮不同批次之间差异较大，不利于高通量筛选药物；传代培养后易失去体内特性，如某些转运体表达被抑制。永生性细胞系也存在某些转运体表达缺失等局限。转基因技术的应用，为建立特异性表达所需转运体的条件永生性细胞系提供了可能。因此体外血一脑脊液屏障细胞模型向能够特异性表达特定转运体的条件永生型细胞培养的方向发展。

脑屏障包括血脑屏障和血脑脊液屏障（图11-11)。本节分别讨论这两种屏障细胞培养模型在药物研发中的应用。血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养血-脑脊液屏障细胞模型转运实验。

［原理和目的］

BBB主要由脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞和基底膜3种成分组成。尽管原代培养的微血管内皮细胞是特征最明显的体外BBB模型，但是由于分离微血管的步骤非常烦琐，需多次重复才能得到大量细胞，限制了高通量药物筛选。多项研究表明，BBB功能的形成并非脑微血管内皮细胞固有的内在特性，而是由于星形胶质细胞的诱导作用所致，所以星形胶质细胞在诱导和维持BBB的完整性上发挥关键性的作用。因此除了原代脑微血管内皮细胞，还可采用其他大动脉或静脉等血管内皮细胞或细胞株，与星形胶质细胞共培养，克服单独培养脑微血管内皮细胞带来的某些局限。血管内皮细胞和星形胶质细胞之间并不直接接触，而是存在一个2～3nm的间隙。因此体外模型中多聚酯多孔膜将内皮细胞和星形胶质细胞分隔开，两者互不接触，但细胞间可以通过分泌的物质进行相互作用。这种共培养方式建立的体外BBB模型在形态结构、功能上与在体BBB非常接近，用于评价药物通过血-脑脊液屏障的能力（图11-12)。

【材料】

1. 1～5日龄健康SD大鼠新生乳鼠；内皮细胞：选自人脑微血管内皮细胞SV-HCEC，大鼠脑血管内皮细胞RBE4,GPNT，小鼠脑血管内皮细胞MBEC4，人脐静脉内皮细胞ECV-304等。

2．试剂 RPMI 1640培养基、胎牛血清、荧光素钠、ZO-1抗体，兔抗胶质纤维酸性蛋白(GEAP）抗体、TRITC标记的羊抗兔IgG、胰酶等

3．仪器 电阻仪，TransweⅡ小室（孔径0.4 um）等。

【方法】

1．星形胶质细胞(astrocyte,As）的原代培养及纯化取1～5日龄健康SD大鼠新生乳鼠，迅速断头置于75％乙醇中浸泡3～5分钟。在洁净工作台中取其脑组织，置于盛有预冷D-Hanks溶液的培养皿中，仔细剔除软脑膜及大血管。在盛有DMEM的培养皿内将大脑皮质组织剪碎至1 mm³左右。转移至离心管中于1000r/min离心10分钟，弃上清液。加入0.25%胰酶盖过大脑皮质组织，于37℃振荡消化20～25分钟后，加入DMEM终止消化。将细胞悬液在1000r/min离心10分钟，弃去上清液，再用DMEM洗细胞2遍。最后用DMEM培养液（含10% FBS,20mmol/L HEPES,2mmol/L谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100 ug/ml链霉素）重悬细胞，用注射器芯挤压脑组织过200目尼龙筛网，收集滤过细胞，DMEM培养液调整细胞密度至（1～2)x10⁵/ml，接种至倒置的细胞25cm2培养瓶中，在细胞培养箱中培养0.5小时后，正置培养瓶。以后每2天换一次液。待细胞融合成单层时（一般经过8～9天），将培养瓶置于37℃摇床250r/min过夜，收集贴壁细胞，用0.1％胰酶消化并传代。每隔2～3天换培养液一次，待细胞在培养瓶内长满至80％～90％时，消化并传代。

2. As细胞的鉴定取第二代As细胞接种至涵盖玻片的培养板中，培养2～3天后，4%多聚甲醛固定15分钟。室温条件下，用含0.3 % Triton, 5 % BSA的PBS破膜处理后，免疫荧光法测定GFAP的表达。荧光显微镜下镜检，GFAP表达阳性，即为As细胞。

3. ECV304/As共培养首先以0.01％鼠尾胶包被TransweⅡTM的多聚酯多孔膜（50ul/cm2)，尔后将其倒置于一较深的培养皿中，将纯化后As细胞以按照（1～2)x10⁶/cm²的密度接种（图11-12B)，加入DMEM培养基（添加1 ng/ml bFGF)。24小时后将TransweⅡTM按正常位置置于24孔培养板中，按照（1～2)x10⁵/cm²接种生长状态良好的ECV304于多聚酯膜上面。小室内外分别加入培养液，保持培养池内外液面相平。每2～3天换培养液一次。

4. ECV304/As共培养模型的形态及功能评价

(1)细胞形态学鉴定：相差显微镜观察，移去培养基，用HBSS清洗后，常规方法固定，进行HE染色，免疫组化法测定紧密连接蛋白ZO-1表达。按常规方法处理扫描电镜标本，观察共培养ECV304细胞表面形态。

(2）试漏试验：显微镜下观察ECV304达融合状态后，将细胞培养液加入细胞培养小室的供给池和接受池，使两池液面差＞2mm（图11-12C)。4小时后观察两池间的液面差是否发生改变。

(3) TEER测定：于接种ECV304细胞3～5天（光镜下细胞完全融合）后，每天在固定的时间用HBSS替换培养液，用跨内皮阻抗测试仪测定ECV304细胞单层的跨内皮细胞电阻(trans-endothelial electrical resistance,TEER）值，以加入HBSS溶液的没有接种细胞的Tran-sweⅡTM做空白对照。计算TEER值（Ω·cm²)。

(4）细胞单层渗透性测定：采用荧光素或者3H-甘露醇检查共培养BBB模型单层细胞完整性。

5．药物摄取实验血管内皮细胞形成单层后，换成含药物的新鲜培养基，贴壁细胞摄取试验研究方法，研究血-脑脊液屏障血管内皮细胞对药物的摄取动力学规律。

6．药物双向转运实验取BBB模型成功的培养单层细胞（光镜下可见，细胞完全融合成形成连接紧密的单层细胞，TEER:100Ω·cm²)，研究血-脑脊液屏障对药物的通透性、外排或转运方向性。

【结果与分析】

1．细胞形态学鉴定

(1) As形态学观察及鉴定：原代培养的As细胞接种于培养瓶后，大部分迅速贴壁生长，0.5～1小时贴壁约大于90%。因此前半个小时培养用于除去少量成纤维细胞。24小时后，可见细胞贴壁，形态呈梭形、三角形或多角形。细胞迅速分裂，并有突起长出，3～4天后镜下可见胞体较大，突起较粗大，数量较多，符合星形胶质细胞特点；另一种胞体小，突起细，数量少，相差显微镜下胞体色深，符合少突胶质细胞特点。8～9天后细胞完全融合成片，机械振荡过夜可除去贴壁不牢、胞体色深的细胞，从而纯化As。GFAP免疫组化显示GFAP阳性表达于胞质及星状突起，即为As细胞；检测细胞阳性率提示原代分离As细胞的纯化率。

(2）共培养细胞模型形态学观察及鉴定：相差显微镜和HE染色显示血管内皮细胞和As以连续单层的形式分别生长于多聚酯膜的两面，形态特点与生长于培养瓶中的细胞无明显差别。电镜技术是唯一能够直接观察紧密连接研究的手段，因此也是评价BBB的重要工具。透射电镜下的紧密连接具有立体感，呈山脊样结构。扫描电镜下可见内皮细胞为孔窗型，呈连续单层生长，细胞之间出现条带样、高密度的紧密连接。也可以免疫组化鉴定紧密连接，ZO-1蛋白在细胞之间条带样阳性表达。

2．试漏试验 在4小时后细胞培养小室内外池保持明显的液面差≥2 mm)，初步认为血管内皮细胞已完全融合，BBB基本形成。

3. TEER测定 跨膜电阻测定是目前研究单层细胞通透性的最精确方法之一。不同实验室建立的BBB模型TEER值相差较大。一般在1～4天上升缓慢，5～7天快速上升期，第8～14天达到平台期。继续培养可能下降。一般TEER值扣除空白后不小于100Ω.cm²。

通常药物转运实验选择TEER平台期进行。

4．细胞单层渗透性测定 荧光素钠（分子量376）是公认的细胞旁路转运标志物，用来作为衡量细胞单层完整性的漏过标志物。与空白值相比，具有显著统计学意义。也有文献认为，荧光素钠漏过率低于1％时，可认为细胞单层具有完整性。

5．药物摄取与双向转运实验从药物浓度一时间曲线可以看出药物转运的一些基本特性，如是否存在饱和性、抑制性转运，转运的方式如被动扩散、载体介导或存在外排系统P-糖蛋白等。从药物摄取率和表观渗透系数可以反映药物通过BBB的能力。对于以被动扩散转运的极性分子，单层摄取实验具有良好的预测性，而跨单层转运实验的相关性很差，可能是跨单层转运模型小分子极性物质主要从细胞间通过内皮单层。而对于有载体参与的跨膜转运，跨单层转运实验预测性与体内更相关。

【注意事项】

1．在此类模型中内皮细胞的来源比较复杂，并且在多数实验中，星形胶质细胞和血管内皮细胞来自不同种属的动物，目前并没有统一和公认的标准，采用同种属的和原代培养的星形胶质细胞共同培养可能更接近在体状态。但也有作者在比较了不同的内皮细胞以后发现人脐静脉内皮细胞系效果最佳。

2．共同培养模型的关键用品是带有聚酷多孔滤膜的插入小室（TransweⅡ)，与多孔培养板配合使用。多孔滤膜的主要技术指标是其孔径的大小，常用的孔径直径为0.4 um和3 um两种。星形胶质细胞足突可以通过3 um的孔径与内皮细胞直接接触，但不能通过0.4 um。目前尚没有充分资料证明哪种孔径更为合适。但是体内环境中，脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞之间存在基底膜，并没有直接接触。因此多数研究者使用0.4 um孔径的插入小室。

3．共培养单层细胞膜完整性的评价体外BBB模型不仅要在形态上还要在功能上尽可能多地模拟体内条件。由于血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养影响因素很多，因此尽管形态学指标具有直接、客观的特点，但是形态学上完整的并不等同于完备的屏障功能。功能评价是确定一个模型是否符合要求的不可或缺的关键步骤。研究方法主要包括：①测定跨单层内皮细胞电阻：它代表了模型对无机离子的通透性，是反映血一脑脊液屏障功能最灵敏的指标；②测定模型对示踪剂的通透性：常用的示踪剂有荧光素、菊酚、蔗糖、辣根过氧化物酶等。前三种代表小分子物质，后者代表大分子物质，根据所研究目的相应选择；③测定功能蛋白的表达，如谷胱甘肽转肽酶.P-糖蛋白、oatp3,ABCG2等药物转运相关酶或转运体。