贴壁细胞的药物摄取实验应用更为广泛，通过实验可以了解转运体对药物的摄取动力学特征，预测药物在体内的吸收、分布、排泄等过程。贴壁细胞来源广泛可以是培养的新鲜组织细胞（如肝细胞）、肿瘤细胞（如应用广泛的Caco-2细胞）、转染特定转运体的转染细胞等。近年来随着分子生物学的发展，特别是转染细胞如OATl-, OAT3-HEK293细胞、OATPIBI-, OATPIB3-HEK293细胞、OATP2Bl-CHO细胞、Oatpl-Xenopus oocyte细胞、PEPT1-Hela细胞等，已经成为药物转运研究和新药开发的重要工具。

【材料】

1．贴壁细胞若干。

2．取试剂胰蛋白酶、小牛血清、非必需氨基酸、培养基（DMEM培养粉或RPMI 1640,M 199等）,0.4％锥虫蓝、待测药物溶液、24孔板、Krebs-Henseleit液（118mM NaC1,23.8mM NaHC0₃,4.8mM KCl，1.OmM KH₂P0₄，1.2mM MgS0₄，12.5mM HEPES，5.0mM glucose，and 1.5mM CaC1₂，调节pH 7.4) ,Triton-X-100,BCA试剂盒。

3．仪器及试剂净化工作台、倒置显微镜、酶标仪、CO₂培养箱、高压灭菌仪、恒温水浴振荡培养箱、高速冷冻离心机、高效液相色谱-质谱联用仪。

【方法】

1．细胞复苏与培养将装有细胞的冷冻管从液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴中，快速摇晃，直至冻存管中冻存液完全融化后取出，以上操作在1分钟之内完成。乙醇消毒瓶盖后打开，吸出细胞液置于含有培养液的具塞离心管中，混合后低速离心，除去上清液，重复洗两次。接种于培养瓶中，在37℃ 5% CO₂相对湿度90％的细胞培养箱中培养。

2．接种培养待细胞密度达到培养瓶面积的70%～80％时用0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA混合消化液消化数分钟，再加入适量培养液，用吸管轻轻吹打细胞成单细胞悬液，调整细胞浓度接种于无菌24孔板中（1x10⁵／孔），继续培养3～5天，待密度达到孔面积70%～80％可进行药物摄取实验。

3．用移液器将24孔板中培养液吸取干净，用预孵至37℃的Krebs-Henseleit液轻柔的清洗2遍，将细胞表面的培养液清洗干净。

4．用移液器将Krebs-Henseleit液（37℃）加入24孔板中（1毫升／孔)置于恒温水浴振荡培养箱中平衡10分钟。

5．用移液器将平衡液吸尽，加入1 ml含待测药物Krebs-Henseleit液（预孵至37℃）开始摄取实验。

6．达到预设的时间点用移液器吸尽药液，同时加入1 ml冷的Krebs-Henseleit液（0℃）终止摄取反应。

7．用移液器吸尽冷的Krebs-Henseleit液，用冷的Krebs-Henseleit液轻柔的清洗2遍以洗净细胞表面吸附的待测药物。

8．用移液器加入0.3 ml/孔的0.1% Triton X-100,37℃振荡裂解1.5小时。

9．取适量细胞裂解液按BCA试剂盒操作说明测定蛋白浓度，剩余裂解液放于-20℃保存；测定时经沉淀蛋白等处理后用LC-MS定量测定。

【结果与分析】

确定药物的线性摄取时间，作药物摄取量随时间变化曲线，从而确定线性摄取时间；根据确定的线性摄取时间，分别在37℃和4℃下进行药物浓度依赖性摄取实验，作药物摄取量随药物浓度变化曲线；由Eadie-Hofstee方程以特异性摄取初速度（υ）对初速度与药物浓度比值（υ/s）计算Km, Vmax，表征待测药物摄取的动力学特征。

【注意事项】

1．有些细胞在低代时容易贴壁，生长良好，在传到几十代以后，易聚集成团，且贴壁不牢，即使消化后也不容易吹打成单细胞悬液，因此最好在购入时先大量冻存。

2．用于药物摄取实验的细胞应处于对数生长期，此期细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。

3．有些细胞不容易贴壁或贴壁不牢，因此在药物摄取实验时用Krebs-Henseleit液清洗尽可能轻柔，防止其脱落。