人类白细胞抗原（human leucocyte antigen, HLA）是一个由一系列紧密连锁的基因座位所组成的具有高度多态性的复合体。位于第六号染色体的短臂6P21.31 区，长3600kB，根据功能和产物结构的不同，分成3组：经典HLA基因、免疫功能相关基因和免疫无关基因。其中经典HLA基因与输血和移植急性排斥反应密切关联。因此，对于经典的HLA基因进行分型在临床上有重要意义。

HLA检测在器官移植、输血、亲子鉴定和疾病诊断上都有临床价值。HLA检测主要指HLA的抗原分型和抗体筛选技术。

一、HLA血清学分型方法

（一）淋巴细胞毒交叉配合试验

【原理】

受体血清中如存在有抗淋巴细胞抗体，在补体存在的情况下，可破坏供体淋巴细胞。加入染料，并利用死细胞可被染料染色、而活细胞抗拒染色的原理，计数染上色的死细胞数，从而判定有无抗淋巴细胞抗体的存在。血清学分型技术被称为淋巴细胞毒交叉配合试验（complement-dependent cytotoxicity)，为HLA抗原分型常用方法。

【材料】

1．微量反应板（Terasaki板）；

2.淋巴细胞分离液 比重1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺（商品名为淋巴细胞分离液）；

3．抗淋巴细胞血清；

4．补体 标准补体为6只以上健康家兔混合血清(-80℃保存）；

5. 2％锥虫蓝或5％伊红 用生理盐水配制；

6．肝素抗凝剂 125U/ml;

7. 12％甲醛。

【方法】

（美国国家卫生研究院一NIH方法）

1．常规分离淋巴细胞取供者肝素化全血3 ml，用PBS或生理盐水作等量稀释，沿管壁滴加于预先加有2ml淋巴细胞分离液的l0ml试管内，水平式离心机2000r/min，离心10分钟，吸取白膜层之淋巴细胞于6ml洗涤液中，1000r/min，离心8分钟，弃上清液，调整细胞浓度至2000/m1。

2．微量淋巴细胞毒试验

（1)微板法：

阳性对照：用抗淋巴细胞血清1 ml代替受者血清；

阴性对照：用生理盐水1 ml代替受者血清。

操作步骤如表10-2。

(2）试管法：操作步骤见表10-3。

【结果】

1．微板法 使用相差显微镜观察，被染色的死细胞呈黑色，无折光，细胞肿胀，活细胞则具有很强的折光能力，呈明亮状，两者很容易区分。

2．试管法从各管取样，滴加于血细胞计数板内，用普通生物显微镜高倍镜计数200个淋巴细胞，计算出蓝染死细胞的百分率。

3．淋巴细胞毒结果解释当试验所设之阳性对照死亡细胞数大于90%，阴性对照死亡细胞数小于2％时，表明此试验结果可靠。临床将细胞毒低于10％作为阴性，大于10％则为移植禁忌。

【注意事项】

1．被检血清方面的问题

(1)混有纤维蛋白的干扰：原因为患者留取血标本时血液仍然存在肝素化。处理方法，可在血浆中加入鱼精蛋白。直接避免方法为，临床必须在患者血透前或血透8小时后再行采血。

(2)混有脂肪、细菌以及其他杂质等颗粒干扰时，可对结果观察带来影响。在细菌污染严重时，也可以杀死淋巴细胞，产生假阳性结果。

(3)由于血清多次反复冻融或者保存或携带过程中温度太高导致被检血清活力下降，而导致假阴性反应结果。

2．淋巴细胞方面的原因

(1)淋巴细胞活力下降时易发生假阳性反应。造成活力下降的原因有：①在携带过程中，外界温度变化以及剧烈震荡，pH的变化等；②在分离过程中，不适当的pH、温度以及离心力等均可能使细胞膜受到损伤。

(2）淋巴细胞悬液污染：①在红细胞污染时，红细胞上的ABO抗原与血清中的ABO抗体作用，要消耗一定量的补体，而且在污染严重时造成计数困难。处理方法：用蒸馏水或新鲜配制的0.83% NH4Cl溶液处理，破坏红细胞；②血小板污染时，会产生一些凝块，影响观察结果，而且血小板也能够与相应抗体作用并消耗补体。处理时可加入凝血酶；③粒细胞污染，不但消耗补体，而且它对兔补体的细胞毒特别敏感，容易死亡而产生假阳性，严重干扰读数。

(3）其他因素：淋巴细胞数量的多少、淋巴细胞悬液中T和B细胞的比例以及细胞毒冷暖抗体等原因都会对结果带来影响。

3．培育时间在交叉配型时，要求有最大的敏感性，可延长培育的时间。

4．培育温度淋巴细胞和抗体的相互作用，在25℃比37℃更为敏感，但不能低于15℃，以免可能出现细胞毒冷抗体的干扰。

5．补体活性和用量补体应避免受热或反复冻融；兔补体应保存于-80℃冰箱，在-20℃只能保存三个月。在细胞毒试验中，补体量应严格控制在5单位，这个量已被国际公认。

6．染色在初次使用某一批号的锥虫蓝或伊红时，应预先检验该产品能否对死细胞进行有效地染色。

【方法学评价】

1．微量法细胞毒试验以其具有血清、细胞及补体用量少，而且经伊红或荧光剂染色后对观察时间上又没有很大限制，特别适合大样本量检测。因此，长期以来广泛应用于HLA分型的研究并已成为一项国际通用标准技术。但是，应用此方法作异体肾移植交叉配型时，在观察具体死亡细胞数方面不如试管法计数准确可靠；同时由于微量法操作时还需要一些特殊的专用器材，在观察结果时又必须使用相差显微镜，不适合那些不具备以上条件的基层单位开展此项工作。

2．试管法细胞毒试验具有取材方便、不需特殊器材及设备、结果计数准确等优点；采用供体自身血清替代兔补体更可克服在补体携带方面的不便，因此被许多移植中心所接受。但值得注意的是由于锥虫蓝（锥蓝）能和清蛋白结合，浓度太低时死细胞不易被着色，浓度太高时活细胞也容易着色；另外锥虫蓝在盐水中溶解度低，容易有沉淀析出。解决方法，可先用蒸馏水配成4％的储存液，临用前再用1.8% NaCl等量稀释，最后再离心除去可能产生的沉淀。