CIK (cytokine-induced killer）细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞，是一种新型的免疫活性细胞，自20世纪80年代发现以来，由美国Stanford大学Robert Negrin等学者将该细胞用于肿瘤治疗。通过免疫表型分析发现CIK细胞中CD3⁺细胞、CD56⁺细胞较多，因此CIK细胞同时具有T细胞和NK细胞的标志，故又称为NK细胞（自然杀伤细胞）样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性，和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。CIK细胞凭借增殖速度快、杀瘤活性高、作用精准、对多重耐药肿瘤细胞同样敏感等优势有望取代LAK细胞成为新一代肿瘤过继细胞免疫治疗的核心力量。

（一）CIK 细胞的制备

CIK细胞属于体细胞疗法范畴，主要是通过分离获取的患者自身细胞，如外周血、骨髓或脐血，在多种细胞因子即IL-2,IL-1,IFN-γ、抗CD3单克隆抗体等存在的条件下，大量扩增出具有高度抗肿瘤活性的免疫表型细胞，再回输到患者体内，临床上常用于手术、放疗和化疗后或无法接受常规治疗的肿瘤患者。

【材料】

1．重组人IL-lα, IL-2；

2．重组人IFN-γ;

3．抗CD3单克隆抗体；

4. AIM-V无血清培养基。

【方法】

1．常规方法分离患者自体外周血单个核细胞，用AIM-V无血清培养基调整细胞悬液浓度为1x106/ml。

2．培养当日在培养体系中加入IFN-γ（1000U/ml)，置37℃,5% C0₂孵箱中培养24小时，然后加入抗CD3单克隆抗体（50ng/ml), IL-2 (300U/ml) , IL-1a(100U/ml）继续培养，以后每3天更换新鲜培养液和补充IL-2，以LAK细胞作为对照组。

3．分别取不同时段的CIK细胞，用直接免疫荧光法，通过流式细胞仪检测CIK细胞的免疫表型。这样制备出来的CIK细胞培养15天，细胞数可增长754倍。在30天的观察期内，细胞增殖高峰时间在第21～28天，细胞数可增长1000倍以上。

4. CIK细胞收获培养终止后离心弃上清液，用生理盐水洗涤细胞2次以上，重新混匀，悬于输注用生理盐水中，用于治疗。

【结果】

在显微镜下CIK细胞呈圆形，体积增大，胞质饱满，折光性好，有颗粒，核增大，细胞表面有很多突起和伪足。流式细胞仪检测发现CD3⁺CD56⁺细胞增多。

【注意事项】

1．细胞培养应该用无血清培养基。

2. INF-γ先于IL-2加入培养体系可以提高细胞毒性，联合应用IL-1则可进一步提高细胞毒力，而INF-γ与IL-2同时或在IL-2之后才加入体系则会降低细胞毒力，故各细胞因子加入的时间和顺序对产生的细胞毒力有重要影响。

3．培养10天后CIK细胞就表现出杀瘤活性，20天达到高峰，因此临床用CIK细胞应在培养后的10～20天内收获。

4. CIK细胞质检 CIK细胞质检包括无菌检测（需氧菌检测，厌氧菌检测，真菌检测，支原体检测）、细胞活性检测和热原质检测。

（二）CIK细胞对肿瘤细胞杀伤活性的检测

CIK细胞活性的测定常采用核素法、MTT比色法、乳酸脱氢酶释放法等。此处介绍MTT比色法。

【材料】

1．试剂与细胞培养板

(1)四甲基偶氮唑盐(MTT);

(2）含0.04mol/L HCl的酸化异丙醇；

(3) 96孔细胞培养板。

2．肿瘤细胞系 K562细胞（红白血病细胞，对NK细胞毒作用敏感），调整细胞浓度至2x10⁶/ml备用。

【方法】

1．用培养液调整CIK细胞浓度至2x10⁶/ml。

2. CIK细胞与白血病细胞株按20:1的效靶比分别取100ul接种于96孔培养板内，每组做3个复孔。效应细胞每孔接种200微升／孔单独培养作为对照，同时设靶细胞对照孔。

3．将上述接种好的细胞培养板置37℃ % C0₂孵箱孵育48小时。

4．于终止培养前，每孔加入MTT 10ul，混匀后再培养4～6小时。

5．吸弃上清液，每孔加0.l ml酸化异丙醇，在振荡器上振荡混匀，让还原产物充分溶解。

【结果】

于酶联仪上测定吸光度（OD)，检测波长570nm。

细胞毒性百分率按下列公式计算：

ODE+T=效应细胞孔OD值+靶细胞孔OD值

ODE=相应浓度单独效应细胞的OD值

ODT=相应浓度单独靶细胞的OD值

【注意事项】

当效靶比为20:1时，应保证CIK细胞对自然杀伤细胞（NK）敏感肿瘤株K562细胞的杀伤率大于50%，对NK不敏感肿瘤株的杀伤率大于30%。