MTS[3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-5（3-carboxymethoxyphenyl）-2-（4-sulfopheny）-2H-tet-razolium, inner salt]是一种四唑类化合物，它与MTT的应用原理相同，即被活细胞线粒体中的多种脱氢酶还原成有色的水溶性产物，其颜色深浅与细胞活性呈高度相关。MTS比MTT更为方便，精简了实验过程。

【材料】

1. MTS 用pH 6.0的PBS配成300mmol/L;

2．吩嗪二甲醋硫酸盐（PMS) 用PBS配制成220mmol/L,4℃避光可保存20天；

3. MTS/PMSMTS与PMS按1：1混合（临用时混合）；

4. K562细胞（靶细胞），淋巴细胞（效应细胞）。

【方法】

1．在96孔细胞培养板中（用前紫外线照射4小时），实验孔加效、靶细胞各100ul，效：靶=10～20：1；靶细胞对照孔只加靶细胞、培养液100ul。每个标本3个复孔，37℃ 5% C0₂孵箱中作用4小时。

2．每孔加MTS溶液20ul，继续孵育2小时。

【结果】

选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。

XTT比色法（NK细胞毒试验）

【原理】

XTT是与MTT类似的四唑氮衍生物，可被活细胞线粒体脱氢酶还原成水溶性的棕色产物，当XTT与电子耦合剂共同使用时，产物的生成量与细胞的增殖程度呈正相关。用XTT代替MTT可省去溶解还原产物结晶的步骤。

【材料】

1. XTT用60℃预热培养液配制成6.6mmol/L，过滤除菌，现配现用。

2．吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)用PBS配制成220mmo1/L,4℃避光可保存20天。

3. XTT/PMS:XTT，与PMS按1：1混合（临用时混合）。

4. K562细胞（靶细胞）,NK细胞（效应细胞）。

【方法】

1．在96孔细胞培养板中（用前紫外线照射4小时），实验孔加效、靶细胞各100ul，效：靶=10：1;靶细胞对照孔只加靶细胞、培养液100ul。每个标本3个复孔，37℃ 5% C0₂孵箱中作用4小时。

2．于终止培养前2小时，每孔加入XTT/PMS 20ul，混匀后再培养2小时。

【结果】

在酶标仪上450nm处测定光吸光度，参考波长为655 nm。计算Sl：Si=试验孔OD均值／对照孔OD均值。

【注意事项】

1. XTT试剂应现用现配。

2．细胞洗涤要充分，操作要无菌、轻柔，保持细胞活性。

CCK-8法（CTL细胞毒实验）

【原理】

所谓CCK-8 (cell counting Kit-8 )法的细胞活性检测试剂中含有WST-8，其化学名为：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-(4-硝基苯基）-5-(2,4-二磺酸苯）-2H-四唑单钠盐，它在电子载体1-甲氧基-5甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS )的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物（Formazan)。生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比。用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。WST-8比MTT,XTT,MTS更加稳定，检测线性范围更宽，灵敏度更高，但价格较贵。

【材料】

1．培养液中靶细胞通常选用传代的肿瘤细胞，配制成（1～3)x10⁶/ml细胞悬液；

2．效应细胞CTL可用受检患者外周血液中分离所得的单个核细胞，洗涤后调整细胞数；

3.CCK-8；

4.RPMI 1640。

【方法】

1．常规方法分离淋巴细胞，在96孔细胞培养板中按照淋巴细胞与肿瘤细胞200:1的效靶比例使两种细胞接触。如果肿瘤细胞为贴壁细胞，则将肿瘤细胞用培养液配成1x10³/ml的细胞悬液，每孔加入细胞悬液100ul（即100个肿瘤细胞，静置5～10分钟，待细胞初步贴壁后，再放入5% CO₂的细胞培养箱中培养24小时。如每孔中含肿瘤细胞为200个，则应加入淋巴细胞4x10⁴个淋巴细胞，即每孔加入4x10⁵/ml淋巴细胞悬液100 ul。

2．用含20％小牛血清的RPMI 1640培养液将每孔液体体积补至200ul，将每孔细胞培养板放入5% CO₂的37℃细胞培养箱内培养24～48小时。

3．每孔加入20ul CCK-8溶液。用加了相应量细胞培养液和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。在细胞培养箱内继续孵育1小时。

【结果】

用酶标仪在450nm测定吸光度值。

【注意事项】

1．如果细胞培养时间较长，一定要注意蒸发的问题。一方面，由于96孔板周围一圈最容易蒸发，可以采取弃用周围一圈的办法，改加PBS，水或培养液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培养箱内水源的地方，以缓解蒸发。

2．本方法的检测依赖于脱氢酶催化的反应，如果待检测体系中存在较多的还原剂，例如一些抗氧化剂会干扰检测，需设法去除。