真菌毒素中毒及其检测

真菌毒素（mycotoxins）是由少数真菌寄生于谷物或水果等农作物上，在适宜条件下产生的具有生物活性的一类物质。真菌毒素主要包括黄曲霉毒素（aflatoxins) ,赭曲霉毒素(ochratoxins)、玉米赤霉烯酮(zearalenone)、单端抱霉烯族毒素（trichothecenes)、烟曲霉毒素（fumonisins)、黄绿青霉毒素（citreovidin）以及麦角生物碱（ergot alkaloids）等几大类，每类中还可以分为若干个亚型，如黄曲霉毒素可分为20多个亚型(B₁ , G₁ , G₂ , M₁等），单端袍霉烯族毒素更是多达几十种（T-2, DON, MON, DAS, NIV等）。据估计目前大约有200余种真菌毒素，其中与人畜关系密切的有近百种。由真菌毒素所引起的人畜中毒，称之为真菌毒素中毒症。

一、真菌毒素的分类及其毒性分级

(1)真菌毒素的分类真菌毒素的分类主要有两种方法。

①根据其所作用的靶组织，可将其分为肝脏毒、肾脏毒、心脏毒、神经毒、造血器官毒、光过敏性皮炎性物质及其他7种。

②根据其化学结构及性质可将其分为11种：生物碱、蒽醌、丁烯酸内酯、香豆素、环氯肽、nonadride、酚大环内酯、哌嗪、吡喃酮和吡喃、藨草镰刀菌烯及其他。

(2)真菌毒素的毒性分级真菌毒素的毒性，由于使用的动物和染毒的途径不同而有差别，根据食品毒理的分级标准，可将常见的25种真菌毒素分为极毒、剧毒、中毒、低毒四种。见表5-1。

二、食品中常见真菌毒素及其致病性

2.1食品中常见真菌毒素及其致病机制

在目前已知的200多种真面毒素中，人们研究的里点集中在毒性强、污染频率高、对人类危害较大的真菌毒素上，主要包括黄曲霉毒素B₁和M₁ (aflatoxins, AFB1, AFM1) ;赭曲霉毒素A (ochraloxinA, OTA )；烟曲霉毒素（fumonisins, F )；玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZFN)、串珠镰刀菌素（moniliformin, MF)；脱氧雪腐镰刀菌烯醇(de-oxynivlenol, DON)；桔霉素（citrinin, CIT)；单端孢霉烯族毒素（trichothecenes, TS)等十几种。这些真菌毒素的致病机制大致如下。

(1）黄曲霉毒素B_l有致癌性，可抑制DNA, RNA的合成，也有细胞毒，还可破坏凝血机制、破坏某些酶类等，从而产生症状或致癌。

(2)赭曲霉毒素可抑制ATP酶、琥珀酸脱氢酶以及细胞色素C氧化酶，从而对羧化过程产生作用。

(3)单端孢霉烯族毒素主要是抑制蛋白质、RNA, DNA等大分子物质的合成，破坏细胞膜和酶类的功能，对造血系统和免疫系统有较强的毒作用。

(4)玉米赤霉烯酮具有雌激素样作用。

(5）烟曲霉毒素作用机制不甚明了，但与某些癌症的发生密切相关。

(6)串珠镰刀菌素主要通过抑制丙酮酸脱氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等发生作用。

(7）桔霉素在线粒体内聚集且干扰电子传递系统．导致DNA合成受到抑制，并进一步使RNA和蛋白质合成受到抑制，肝糖原下降，胆固醇和甘油三酯合成受阻。

2.2真菌毒素的致病性

(1)真菌毒素食物中毒相对来说真菌毒素一般都是相对分子质量小的物质，通常不被食物的烹调加热所破坏，所以在某种程度上比细菌毒素更危险。因细菌毒素的相对分子质量很大，在加热时极易破坏其化学结构，从而丧失其毒性。一次大量摄人真菌毒素可引起急性中毒，急性中毒主要引起腹泻、恶心、呕吐、腹痛等消化系功能紊乱的症状，严重者可发生嗜睡、昏迷甚至死亡。慢性中毒的症状多种多样，而且不同毒素间的差异很大。真菌毒素引起的中毒不但与毒素的毒性和质量浓度有关，也与加工工艺有关，某些加工方式可以使毒素大量增加，如制粉过程和啤酒麦芽发酵的过程中都可使毒素含量成倍增加。此外，一些动物食品如牛乳、肉类因真菌毒素的残留也可以对人体发生损害。

(2)真菌毒素的“三致”作用

①真菌毒素的致癌性：到目前为止，已知有14种真菌毒素有致癌性。其中，经口服致癌的有AFB₁, AFB₂ , AFG, AFM₁, AFL（黄曲霉毒醇）、杂色曲霉素、黄天精、环氯素、岛青霉素和皱褶青霉素10种；经皮下注射，可引起实验动物产生肉瘤者，有展青霉素和青霉酿2种；需与其他化学物质协同作用而使实验动物产生肿瘤者，有灰黄霉素和赭曲霉素A两种。在这些毒素中，以黄曲霉毒素的致癌性最强，能使多种实验动物致癌，如大白鼠、虹蹲鱼、脉鼠、雪貂、绵羊、猴、鸭、小白鼠等，其中以大白鼠、虹鳟鱼最为敏感。黄曲霉毒素B1是一种最强的自然致癌物质，从国内外肝癌高发区的流行病学调查发现，肝癌高发区食品中的黄曲霉毒素含量与人类肝癌的发病率有平行关系。因此限定食品中黄曲霉毒素的含量和加强食品中黄曲霉毒素的检测具有重要的意义。

②真菌毒素的致畸性：早在1960年就知道了黄曲霉毒素对地鼠、小白鼠、大白鼠有致畸性。此外灰黄霉素、红色青霉素B,赭曲霉素A和T-2毒素对哺乳动物有致畸性。细胞松弛素B及展青霉素对鸡胚也表现出致癌作用。20世纪70年代又发现桔青霉素、纯绿青霉素和链抱霉醇具有杀胚胎或抑制生长作用。

③真菌毒素的致突变性：关于致突变性的研究多集中于黄曲霉毒素。日本学者上野曾对35种真菌毒素及其衍生物的致突变性和潜在的致癌作用，用枯草杆菌重组试验进行筛选，结果发现黄曲霉毒素B1和G1、桔青霉素、皱褶青霉素、黄天精、展青霉素、青霉酸、娄地青霉素、杂色曲霉素、O-乙酰杂色曲霉素、O-乙酰二氢杂色曲霉素、玉米赤霉烯酮和玉米赤霉烯醇-6呈阳性。在这13种毒素中有8种是有致癌性的。但已知有致癌性的展育霉素和环氯素在重组试验中却呈阴性。另外，赭曲霉毒素A是近年来在国内比较受关注的一种真菌毒素，其毒性比黄曲霉毒素B1更大，主要危害肾，造成肾肿大，也可造成肠炎、淋巴坏疽、肝大等。现已发现有7种曲霉和6种青霉能产生赭曲霉毒素，其中曲霉和鲜绿青霉为主要产毒菌。在国内某些地区的分布比黄曲霉毒素还要广泛，危害相当严重。

为了控制真菌毒素对食用者的危害，国内外粮食豆类各级标准中都规定了真菌毒素的安全指标（表5-2)。

三、真菌毒素的常用检验方法

随着生物学、生物化学、分析化学、免疫化学及仪器分析等的发展，促进了真菌毒素检验方法的飞跃进展。到目前为止，大致有生物鉴定法、免疫分析法、化学分析法和仪器分析法。

(1)生物鉴定法生物鉴定法分为幼年动物鉴定实验、胚胎和卵鉴定实验、组织培养鉴定实验、豚鼠鉴定实验，植物鉴定实验、微生物实验、水生动物鉴定实验等。根据生物摄入或添加真菌毒素后产生的病变、死亡或异常来判定毒素危害，通过生物体实验来验证其毒性部位和毒性机理。该方法对样品纯度要求较低，存在少量杂质对检测结果不会造成大的影响，具有一定的应用价值，主要作为定性实验判断真菌毒素的存在性。但生物鉴定法的专一性不强，灵敏度较低，费用较高，实验周期较长，对工作人员的操作技术也有较高要求，一般只作为化学分析法的佐证。

(2)免疫分析法免疫分析法是利用抗原抗体反应特异性的原理，达到对真菌毒素检测的目的。此方法不仅具有高度特异性、高灵敏度以及稳定、快速简便等特点，而且可以在组织、细胞和分子等不同层次、不同水平上应用。

①酶联免疫吸附测定法：酶联免疫吸附测定法（ELISA）是近年来发展最快的免疫学检测方法，具有特异性强、灵敏度高、前处理简单、不需要昂贵仪器、技术上易于推广等优点，特别适用于大量样品中真菌毒素含量的检测工作。江涛等运用间接竞争ELISA法检测样品，所用的抗总黄曲霉毒素单克隆抗体对黄曲霉毒素（B₁, B₂, G₁, G₂）的交叉反应率分别为100％, 57.5％, 104％和19％，与其他真菌毒素无交叉反应，特异性较高。但是ELISA法存在一定的假阳性，不能作为最终的确证方法。

②放射免疫检测法：放射免疫检测法以放射性同位素为标记物标记标准品，然后与样品混合，加入定量特异性抗体。由于样品中的抗原浓度与抗体抗原复合物中放射性强度成反比，根据对抗体抗原复合物的放射性计数，可计算样品中的抗原浓度。该法灵敏度很高、特异性强。但放射性元素易造成污染，标准品难以保存，且该法必须与液体闪烁计数器等仪器连用，价格昂贵，成本较高，技术推广上具有一定难度，因此该法的应用受到一定限制。

(3）化学分析法最常用的是薄层色谱法，此方法经济实用，对设备要求不高，较易于推广。随着高效薄层色谱法及薄层扫描仪的发展，拓宽了薄层层析色谱技术在检测真菌毒素领域中的应用。该法目前仍作为发展中国家检测真菌毒素，特别是检测本身能够发荧光的真菌毒素的常规方法，但此法精确度低、操作过程复杂，近年来的应用受到限制。

(4）仪器分析法仪器分析法指对样品进行一定的提取、净化等前处理步骤之后，借助检测设备对样品进行定性、定量分析。此类方法分析的准确度高、定量限低，是目前真菌毒素检测比较通用、受到广泛认可的方法。

①仪器分析法前处理净化方式：为获得一定的选择性和灵敏度，常常需要对提取液进一步净化。净化是指在上机检测前，采用一定的方式去除提取液中的杂质（如脂肪、蛋白、色素等），以避免对真菌毒素分析产生干扰，有的净化方式（如固相萃取）还能起到富集毒素的作用。

a．液液萃取净化：液液萃取是利用相似相溶原理，选择适当的溶剂和萃取条件对样品进行净化。SN0589-1996高效液相色谱紫外检测器法测定饮料中的棒曲霉毒素法中，试样中的棒曲霉毒素经乙酸乙酯提取，提取液经碳酸钠溶液净化后，上机检测。此种净化方法简单、经济；缺点是净化效果比较差，不适用于复杂基质。

b．固相萃取净化

Ⅰ、免疫亲和色谱柱：免疫亲和技术是利用免疫化学反应原理，以抗原或抗体一方作为配基，亲和吸附另一方的亲和色谱分离系统，它可以选择性吸附提取液中的抗原物质—真菌毒素。此方法具有高灵敏度、高选择性、高特异性、溶剂消耗少、净化效果好、回收率高的特点，被很多官方机构作为认可的检测方法；缺点是免疫亲和柱的价格昂贵，同时由于其高特异性的特点，无法进行多残留检测。目前已经商业化的有黄曲霉毒素（B1, B2, G1,G2),赭曲霉毒素、烟曲霉毒素、玉米赤霉烯酮等毒素的免疫亲和柱。

Ⅱ、传统固相萃取柱：固相萃取（SOILD PHASE EXTRACTION，简称SPE）是一个包括液相和固相的物理萃取过程。在固相萃取过程中，固相对分析物的吸附力大于样品母液，当样品通过固相柱时，其他样品组分则通过柱子，而分析物被吸附在固体表面，然后可用适当溶剂洗脱下来。此技术净化效果好、适用范围广、价格适中，节省有机试剂，对环境比较友好，因而在残留分析前处理中被普遍应用；但此方法只适合分析一种或者一类化合物，不适用于多残留分析。

Ⅲ、多功能净化柱：多功能净化柱是一种特殊的固相萃取柱，它以极性、非极性及离子交换等几类基团组成填充剂，可选择性吸附样液中的脂类、蛋白类、糖类等各类杂质，待测组分真菌毒素不被吸附而直接通过，从而一步完成净化过程，净化效果比较理想。此方法操作简单、净化效果较好、适用于多残留分析；缺点是对部分真菌毒素有一定的吸附，因而回收率偏低。

c．基质固相分散：基质固相分散（matirxsilod-phasediseprsino, MSPD）是类似于固相萃取的一种提取、净化、富集技术，其基本原理是将试样直接与适量反相填料研磨、混匀制成半固态物质，然后装柱，用洗脱剂淋洗。根据分析物在聚合物组织基质中的分散和溶剂的极性将分析物迅速分离。该方法缺点是重复性差，实验操作对结果影响比较大。

②检测方式

a.荧光光度计：荧光光度计是一种利用某些物质被紫外线照射后能发出反应该物质特征的荧光这一原理而研制的超微量分析仪器。荧光从人射光的直角方向检测，即在黑背景下检测荧光的发射，所以荧光光度计可比其他分光光度计的灵敏度高出2-3个数量级，检测低限可达10-5.10-6 ug/mL。国标GB/T 18980-2003通过免疫亲和色谱荧光光度计法对黄毒霉毒素进行了检测，此方法灵敏度高，避免了有毒标准品的使用，缺点是只能检测一类毒素的总量，存在一定的假阳性，不能作为确证方法。

b．高效毛细管电泳法：高效毛细管电泳技术是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。它结合了电泳技术与色谱技术，具有灵敏度高和分析效率高、样品需求量少、节省溶剂用量等特点，可用于食品、粮食中玉米赤霉烯酮等真菌毒素的分析与检测。

c．气相色谱法及GC-MS法：先使用气相色谱法即通过气相色谱柱对真菌毒素进行分离，再使用质谱或经氟酞基化试剂衍生后用电子谱获检测器来进行检测。此方法常用于分析热稳定、易挥发性、分子中不含发色基团和荧光基团，或具有弱荧光或弱吸收的真菌毒素。由于大多数真菌毒素对热不稳定，气相色谱法分析的毒素种类有限，目前主要用来检测单端抱霉烯族化合物。

d．高效液相色谱法及LC-MS-MS法：先使用高效液相色谱法即在适宜的流动相条件下，采用反相C18柱使毒素分离，再通过紫外、荧光、质谱进行检测。此方法适用于大多数真菌毒素分析，具有稳定可靠、灵敏高等特点，是目前比较认可的通用检测方法。尤其是液相色谱结合质谱联用技术，可以同时提供目标化合物的保留时间和分子结构信息，具有杂质影响小、对净化要求低、灵敏度高、适合多组分分析等优点，并且可以进行定量分析与定性确证。

由于真菌毒素的种类繁多，化学性质各不相同，而每种检测方法都有其适用范围和优缺点，因此可以根据实际情况来选择检测方法。但从整个真菌毒素检测技术的现状和发展来讲，简单快速、适合多组分残留分析的前处理方式，再借助准确灵敏的液相色谱一串联质谱法，无疑是今后真菌毒素分析和检测技术的发展方向。