沼气发酵的微生物学过程比较复杂，是由多种细菌联合作用的结果。可分为三个阶段，依次为：水解阶段、产酸阶段、产气阶段。

    第一阶段：水解阶段。由多种厌氧或兼性厌氧的水解性或发酵性细菌将纤维素、淀粉、蛋白质、脂类等复杂有机物水解成相应的单体，并对水解产物进行发酵，产生乙酸、丙酸、丁酸、琥珀酸、乙醇、CO₂和H₂。例如，多糖先水解为单糖，再通过酵解途径进一步发酵成乙醇和脂肪酸，如丙酸、丁酸、乳酸等；蛋白质则先水解为氨基酸，再经脱氨基作用产生脂肪酸和氨。参与本阶段的细菌有梭菌属、拟杆菌属、真杆菌属、双歧杆菌属和丁酸弧菌属等专性厌氧菌以及链球菌属和一些肠道杆菌等兼性厌氧菌。

    第二阶段：产酸阶段。由厌氧的产氢产乙酸细菌群将用第一阶段的发酵产物丙酸、丁酸等脂肪酸和乙醇等转化为乙酸、CO₂和H₂。    

    第三阶段：产气阶段。由严格厌氧的产甲烷细菌群利用一碳化合物(CO₂、甲醇、甲酸、甲胺或CO)、二碳化合物(仅有乙酸)和H₂产生CH₄。研究表明，厌氧生物处理过程中约有70％CH₄产自乙酸的分解，其余少量则产自H₂和CO₂的合成。