［概要］用胰蛋白酶消化BudR标记的两个细胞周期并停留在分裂中期的细胞，在低张缓冲液中孵育细胞，然后固定。用Hoechst33258处理细胞后制备载有细胞的载玻片，光降解染色体。用吉姆萨进行染色体染色，在光学显微镜的油镜下进行观察。

【材料】

1.D-PBSA。

2.PE10mmol/LEDTA(溶于PBSA)。

3．消化液0.25%胰蛋白酶。

4.BudR(Sigma)用无菌纯水制备1mmol/L储备液。

5.Karyomax秋水仙酰胺，10μg/ml。

6.Sorensen's缓冲液磷酸缓冲液，0.066mo1/L,pH6.8。

7．甲醇：醋酸（3:1），置于冰上，新鲜配制。

8．吉姆萨原溶液（0.76%）将1g吉姆萨粉末置于66m1甘油中，56-60℃水浴1.5-2小时，待溶液冷却后，加入66m1无水乙醇。

9．吉姆萨稀释液用Sorensen's缓冲液稀释到3.5%,pH6.8。

10.Hoechst3325820μg/ml(溶于超纯水）。

11．乳胶照相封固剂或豁合剂。

12．二甲苯。

13.DPX封胶。

14．科普林缸。

15.短波紫外线灯及照射盒。

【操作步骤】

1．细胞培养常规培养细胞，加入BrdU，终浓度为10μmol/L。

2．继续避光培养48小时，依据细胞周期时间的不同，在收获前1-6小时加入秋水仙酰胺。

3．消化细胞后离心，在沉淀上方留下约1.2ml上清，重悬细胞。

4．缓慢加入l0ml低张缓冲液，室温孵育细胞悬液10-15分钟。

5．离心，在沉淀上方留下约1.2m1上清，重悬细胞。

6．加入10ml冰冷的固定液，最初逐滴加入，每加入一滴都要充分混匀。冰上放置10分钟。

7．重复第5-6步，将细胞留在固定液中4℃过夜，以改善制片效果。

8．离心细胞，用3-5ml甲醇／醋酸重悬细胞。

9．将细胞储于-20℃。

10．用一根短的巴斯德玻璃吸管，吸取约500μl固定过的细胞。

11．准备载玻片，拿住载玻片，使其斜向下方。手持巴斯德吸管，在载玻片上方至少15cm处，滴3滴细胞悬液在载玻片上。

12．避光，空气中晾干载玻片。

13．在相差显微镜下检查载玻片，确保载玻片上中期细胞分布均匀，并且染色体分散良好。

14．将载玻片浸入盛有20μg/mlHoechst33258的科普林缸中，放置10分钟。

15．将载玻片转移到玻片架上，每片上滴500μl2×SSC。

16．盖上盖玻片，周围用暂时性的薪合剂封上，以防蒸发。

17．将载玻片放在玻片架上，盖玻片朝下，将玻片架放入短波紫外盒中。载玻片与紫外光源之间保持大约4cm的距离。载玻片在紫外光下暴露的时间越长，形成的浅色染色体也就越浅。将载玻片暴露在紫外光下约25-60分钟。

18．将载玻片上的盖玻片拿开，用超纯水清洗载玻片3次，每次5分钟。用铝箔包裹玻片架。

19．避光，空气中晾干载玻片。

20．将载玻片放入盛有3.5％吉姆萨溶液（用Sorensen缓冲液配制，pH6.8)的科普林缸中，染色3-5分钟。

21．用自来水小心漂洗载玻片，用吸水纸吸去水分。

22．将载玻片在实验台上放置1小时，晾干。把载玻片在二甲苯中浸一下，每张载玻片上滴4滴DPX封胶，将一张盖玻片缓慢放下，用吸水纸将气泡排出。干燥，镜检。

23．如果没有SCE发生，那么每条染色体都有一个连续染色的浅色染色单体以及一条连续染色的深色染色体。如果一条染色单体上有一深染区，然后是一浅染区，那么其姐妹染色单体上就为一浅染区，然后是一深染区，这样就表示发生了一处SCE。一个在染色上不连续的点计做是一个SCE。

24．对每个细胞内的SCE的数目以及每个细胞内的染色体数进行计数。

25．大型染色体的SCE数目通常比小型染色体的要多。此外，不同细胞的SCE的发生率也有所不同，因而，对每条染色体的SCE进行评分是测定姐妹染色单体交换速率的一种更准确的方法。SCE分数按以下公式计算：

对于每个要研究的细胞系力求要对大约50个分散的分裂象进行记分。

［注意］Hoechst33258具有致癌性，要在通风橱中称量与溶解。