【原理】将指数生长期的细胞暴露在待测药物中，暴露的持续时间通常取决于产生最大损伤所需的时间，但是它也受药物稳定性的影响。将药物撤除后，让细胞再增殖2-3个群体倍增时间(PDT)，这样就可以把能够增殖的存活细胞与那些不能增殖的存活细胞区别开来。然后用MTT染料还原反应测定存活细胞的数目。

【材料】

1．培养液。

2．消化液0.25%胰蛋白酶。

3.MTT。

4．二甲基亚砜(DMSO)。

5.ELISA读板仪。

【操作步骤】

1．用胰蛋白酶消化汇合的单层细胞，将细胞收集到含血清的培养基中。

2．离心细胞悬液，使细胞沉积下来。用培养基重悬细胞，计数。

3．接种细胞用培养基配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到％孔板（这要依细胞系的生长速度而定），每孔体积200μl，边缘孔用无菌PBS填充。

4．培养细胞同一般培养条件，可根据试验目的和要求决定培养时间。

5．用培养基将待测药物5倍系列稀释，共制备8个浓度。选择浓度时应以最高浓度下多数细胞被杀死，而最低浓度时不会杀死细胞为标准。只要对药物的毒性有所了解，便可采用较小的浓度范围。一般情况下，每种药物使用3块培养板，这样一次试验中可以有三个平行测定结果。

6．在第2列和第11列的8个孔中加入200μl新鲜配制的培养基，这些细胞作为对照。

7．在第3-10列的细胞中加入细胞毒性药物。每个药物浓度仅需4个孔，这样A-D行可用于第一种药物，E-H行用于第二种药物。

8．向每组4孔中各加入药物溶液。

9．继续培养至确定时间。

10．在药物作用期结束时，去除所有含有细胞的孔中的培养基，加入200μl新鲜的培养基。

11．每日换液至2-3个PDTs（群体倍增时间）。

12．呈色药物作用结束后，每孔加MIT溶液(5mg/ml用PBS配制，pH=7.4，即0.5%MTT)
20μl，以铝箔包裹培养板，继续孵育4小时。4小时是最短温育时间，可延至8小时。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。

13．终止培养小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150μlDMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。

14．比色选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以药物浓度为横坐标（X轴），吸光值为纵坐标（Y轴）绘制曲线图。第2列和第11列各孔中得出的平均吸光值作为对照吸光值，对照组吸光值减少1/2时所需的药物浓度为IC50浓度。

［注意事项]

1．选择适当的细胞接种浓度。

2.避免血清干扰一般选＜10％的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。

3．设空白对照与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。

4.MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系。

5.MTT溶液的配制方法通常，此法中的MTT浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT0.5g,溶于l00ml的磷酸缓冲液（PBS)或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。MTT一般最好现用现配，过滤后4℃避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20℃长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。