6 测定步骤

6.1 拭样预处理

按SC/T 3016 的规定执行。

6.2 提取净化

称取（5.00±0.02）g试样于50mL离心管中，加入3g无水硫酸钠（4.6），涡动20s，加乙腈（4.2）15mL，充分均质混匀，4000r/min离心10mm，取上清液于另一离心管中。另取一50mL离心管，加入10mL乙腈（4.2），清洗刀头。清洗液用来溶解上一步的残余物，重复提取一次，合并2次提取液。提取液中加入乙腈饱和的正己烷溶液（4，10）15mL，充分振荡，3000r/min离心5min，弃上层正己烷。再加乙腈饱和的正己烷溶液（4.10）10mL重复脱脂一次。下层转至100mL鸡心瓶中，50°C旋蒸至近干，加乙酸乙酯5mL，涡动1min，静置30s，上清液转移至50mL离心管。鸡心瓶中加正己烷10mL，涡动30s，静置30s，上清液转移至同一个离心管。再用正己烷10mL洗涤鸡心瓶一次，合并3次残余物溶解液，备用。

氨基固相萃取柱依次用乙酸乙酯和正己烷各5mL活化，取备用液全部过柱（流速不超过1mL/min），再依次用正己烷、正己烷-乙酸乙酯（4.7）各5mL淋洗。依次用正己烷-乙酸乙酯（4.8）和乙酸乙酯各4mL洗脱，合并2次洗脱液，50°C氮气吹干。

残余物用乙腈溶液（4.9）1.0mL溶解，涡动混匀，过0.2 μm滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。

6.3 空白添加标准曲线的制备

分别精确取6种玉米赤霉醇类药物混合标准储备液适量，添加到5.00g空白试样中，制得浓度在0μg /kg~100.00μg /kg范围内的5个〜7个不同添加浓度的试样，按6.2步骤操作，供液相色谱-串联质谱仪测定。

6.4 测定

6.4.1 色谱条件

a）色谱柱：BEHC18（2.1mmX50mm，粒径1.7μm）；或相当者。

b）流动相：A相：水；B相：乙腈。

c）流速：0.3mL/min。

d）柱温：35°C。

e）进样体积10μL。

f）流动相梯度洗脱程序见表1。

6.4.2 质谱参考条件

a）离子源：电喷雾离子源。

b）扫描方式：负离子扫描。

c）检测方式：多反应监测（MRM）

d）电离电压：2.6kV。

e）离子源温度：110°C。

f）雾化温度：380°C。

g）雾化气流速：600L/h。

h）药物保留时间、定性离子对、定量离子对、锥孔电压和碰撞能量见表2。

6.4.3 定性依据

在同样的测试条件下，阳性样品保留时间与标准物质保留时间之间的相对标准偏差应在±5%以内，且监测到的离子的相对丰度，用与最强离子基峰的强度百分比表示，应当与浓度相当的校正标准相对丰度一致，校正标准可以是标准品溶液，也可以是添加了标准物质的样品。基峰与次强碎片离子相对丰度比符合表3的要求。空白添加标准溶液的质量色谱图和玉米赤霉醇类药物子离子的质谱图见附录A中的图A1〜图A7。

6.4.4 定量测定

按6.4.1和6.4.2设定仪器条件，待仪器稳定后，取样品制备液和空白添加混合标准工作溶液进行测定，作单点或多点校准，外标法计算样品中药物的残留量，定量离子采用丰度最大的二级特征离子碎片。样品溶液及空白添加混合标准工作溶液中α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮的峰面积均应在仪器检测的线性范围之内。

6.5 空白试验

除不加标样外，按照上述测定条件和步骤进行平行操作。

文章来源：《水产品兽药残留限量及监测方法查询手册》

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