（一）贴壁培养

贴壁培养是指贴壁依赖型细胞贴附在一定的固相表面进行的培养。

1．细胞生长特性

贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于培养（瓶）器皿壁上，细胞一经贴壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。接种密度合适时，一般数天后就铺满培养表面，并形成致密的细胞单层。

2．贴壁培养的优点

由于细胞紧密赫附于固相表面，容易更换培养液。可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新鲜培养液。

容易采用灌注培养，从而达到提高细胞密度的目的。因细胞固定表面，不需过滤系统。

3．贴壁培养的缺点

扩大培养比较困难，投资大，占地面积大，不能有效监测细胞的生长。

4．细胞贴壁的表面

要求具有净阳电荷和高度表面活性。对微载体而言还要求具一定电荷密度，若为有机物表面，必须具有亲水性，并带阳离子。

5．贴壁培养系统

主要有转瓶、中空纤维、玻璃珠、微载体系统等。

转瓶培养系统是贴壁依赖型细胞最初采用的培养系统。转瓶培养一般用于小量培养到大规模培养的过渡阶段，或作为生物反应器接种细胞准备的一条途径。细胞接种在旋转的圆筒形转瓶中，培养过程中转瓶不断旋转，使细胞交替接触培养液和空气，从而提供较好的传质和传热条件。转瓶培养具有结构简单，投资少，技术成熟，重复性好，放大只需简单地增加转瓶数量等优点。但也有其缺点，如劳动强度大，占地空间大，单位体积提供细胞生长的表面积小，细胞生长密度低，培养时监测和控制环境条件受到限制等。现在使用的转瓶培养系统包括二氧化碳培养箱和转瓶机两类。

生物反应器贴壁培养时，细胞贴附于固定的表面生长，不因为搅拌而跟随培养液一起流动，因此比较容易更换培养液，不需要特殊的分离细胞和培养液的设备，可以采用灌流培养获得高细胞密度，能有效地获得一种产品。但扩大规模较难，不能直接监控细胞的生长情况，故多用于制备用量较小、价值高的生物药品。
CelliGen,CelliGenPlusTM和Bioflo3000反应器是常用的贴壁培养式生物反应器，用于细胞贴壁培养时可用篮式搅拌系统和圆盘状载体。此载体是直径6mm无纺聚酯纤维圆片，具有很高的表面积与体积比（1200cm2/g)，利于获得高细胞密度。

篮式搅拌系统和载体培养是目前贴壁细胞培养使用最多的方式，用于杂交瘤细胞、Hela细胞、293细胞、CHO细胞及其他细胞培养。此种方式培养细胞，细胞接种后贴壁快。

（二）悬浮培养

悬浮培养是指悬浮型细胞在反应器中自由悬浮生长的过程。主要用于非贴壁依赖型细胞培养，如杂交瘤细胞等，是在微生物发酵的基础上发展起来的技术。
无血清悬浮培养是用已知人源或动物来源的蛋白或激素代替动物血清的一种细胞培养方式，它能减少后期纯化工作，提高产品质量，正逐渐成为动物细胞大规模培养的研究新方向。

（三）固定化培养

固定化培养是将动物细胞与水不溶性载体结合起来，再进行培养。

贴壁依赖型细胞和悬浮型细胞都可适用于固定化培养。固定化培养具有细胞生长密度高，抗剪切力和抗污染能力强等优点，细胞易于产物分开，有利于产物分离纯化。

固定化培养的制备方法很多，包括吸附法、共价贴附法、离子／共价交联法、包埋法、微囊法等。

1．吸附法

用固体吸附剂将细胞吸附在其表面而使细胞固定化的方法称为吸附法，是动物细胞固定化中最早研究使用的方法。优点是操作简便、条件温和。缺点是载体的负荷能力低，细胞易脱落。微载体培养和中空纤维培养是该方法的代表。

2．共价贴附法

利用共价键将动物细胞与固相载体结合的固定化方法称为共价贴附法。此法可减少细胞的泄漏，但须引入化学试剂，对细胞活性有一定的影响，且因贴附而导致扩散限制小，细胞得不到保护。

3．共价交联法

双功能试剂处理细胞悬浮液，会在细胞间形成桥而絮结产生交联作用，此固定化细胞方法称为共价交联法。交联试剂会使一些细胞死亡，也会产生扩散限制。

4．包埋法

将细胞包埋在多孔载体内部制成固定化细胞的方法称为包埋法。优点是步骤简便、条件温和、负荷量大、细胞泄漏少，抗机械剪切。缺点是扩散限制，并非所有细胞都处于最佳基质浓度，且大分子基质不能渗透到高聚物网络内部。

一般适用于非贴壁依赖型细胞的固定化，常用载体为多孔凝胶，如琼脂糖凝胶、海藻酸钙凝胶和血纤维蛋白。

5．微囊法

微囊法是指用一层亲水的半透膜将细胞包围在珠状的微囊里，细胞不能逸出，但小分子物质及营养物质可自由出人半透膜的培养方法。

囊内是一种微小培养环境，与液体培养相似，能保护细胞少受损伤，故细胞生长好、密度高。微囊直径控制在200-400μm为宜。

制备中应注意保持温和、快速、不损伤细胞的操作手法，尽量在液体和生理条件下操作。所用试剂和半透膜材料对细胞应无毒性，膜的孔径应小于培养细胞，但能使营养物和代谢物自由通过，膜应有足够机械强度抵抗培养中搅拌。

（四）抗凋亡策略在细胞大规模培养中的应用

在生物反应器用于动物细胞大规模培养的过程中，细胞凋亡在细胞死亡中占主要部分，占到80％左右。而在大规模细胞培养中，细胞死亡是维持细胞高活性和高密度的最大障碍。理论上讲，防止或延长细胞死亡，可以极大提高生物反应器生产重组蛋白的产量。

细胞凋亡由一系列基因精确地调控，是多细胞生物发育和维持稳态所必需的生理现象。已知凋亡的最终执行者是Caspase家族，它们均为半胧氨酸蛋白酶，各识别一个4氨基酸序列，并在识别序列C端天冬氨酸残基处将底物切断。Caspase含有可被自身识别的序列，可以切割活化自身而导致信号放大，并作用于下游Caspase成员，从而形成Caspase家族的级联放大，最终作用于效应蛋白，引起细胞凋亡。所以在大规模培养时干扰细胞在培养中凋亡的发生，提高细胞特异性抵制遇到压力而引起凋亡的能力，有利于提高细胞的培养密度、延长细胞的培养周期，从而提高目标产品的产量2-3倍。

1．营养物质抗凋亡

在常规生物反应器构造中，营养耗竭或缺乏培养基中特殊的生长因子则引起凋亡，例如血清、糖或特殊氨基酸的耗尽。培养基中添加氨基酸或其他关键营养可抑制凋亡、延长培养时间从而提高产品的生产。大规模培养中细胞凋亡主要由于营养物质的耗竭或代谢产物的堆积引起，如谷氨酞胺的耗竭是最常见的凋亡原因，而且凋亡一旦发生，补加谷氨酞胺已不能逆转凋亡。另外，动物细胞在无血清、无蛋白培养基中进行培养时，细胞变得更为脆弱，更容易发生凋亡。

2．基因抗凋亡

与凋亡相关的一系列基因产物可对其进行正、负向的调控，因此可通过导入相应基因来调节细胞凋亡的机制。Bcl-2基因是目前最为有效的抗凋亡基因，在多种细胞系中均表现出很强的抗凋亡活性。

3．化学方法杭凋亡

凋亡发生时，细胞许多部位发生生化物质的改变，有些变化如改变细胞氧化还原条件产生活性氧在凋亡信号阶段发生，其他的如破坏线粒体膜电位、激活Caspase则发生在凋亡效应阶段，这在绝大多数细胞死亡中是相同的。

因此，阻止这些生化物质的改变可能阻止或至少延迟细胞凋亡的发生，运用化学物质可抑制信号效应阶段的发生，被认为是抗凋亡策略之一。