[仪器与材料]

低速冷冻离心机，CO2培养箱，倒置显微镜，超净工作台，10％Bs-细胞液，Hank's缓冲液，添加有0.02%EDTA的0.25％胰蛋白酶消化液，离心管，长丝滴管，废液缸，酒精棉球。

[操作步骤]

1．收件检查

细胞株系名称核对。

在途时间累计，指从离开寄出机构算起直到实验室收件人接收的这段时间。在途累计时间对于评估所接收细胞株系的处置非常有用。

从外包装小心取出细胞培养物（培养瓶或冻存管）。

2．无菌操作准备

超净工作台消毒灭菌，有关无菌器材（离心管、移液管、长丝滴管等）准备和检查，完全培养液及胰蛋白酶无菌溶液室温平衡。

培养方瓶外部用酒精棉球消毒。

3.镜检

(1)细胞活性检查

汇合度观察评估细胞密度；

取样染色检查细胞活性。

(2)微生物污染检查

培养液颜色观察；

培养液澄清度检查；

疑似细菌污染或霉菌污染检查。

4．细胞收集

在已灭菌的超净工作台内，小心去除瓶口密封胶，用酒精棉球擦拭瓶口。

小心去除其中的一半培养液。悬浮细胞则需收集所有培养液。

用无菌长丝滴管仔细吹洗部分贴壁的细胞，或用0.25%胰蛋白酶无菌溶液37℃孵育5-20min，再用无菌长丝滴管仔细吹洗。镜检，检查吹洗程度，要求接近100％细胞已经从瓶底表面洗落。

将上述悬浮状态的细胞转移到50m1离心管内，800-1000r/min离心6min。小心弃除上清。

5．扩大培养

弹指法散开沉淀的细胞团，按传代比例添加新鲜培养液悬浮细胞。接种到2-3个25cm2方瓶或1个75cm2方瓶。

静置5.10min后镜检。送入CO2培养箱培养。

6．冻存

(1)培养使细胞进入对数生长中、晚期，然后收集细胞，方法类似步骤4。取离心前细胞悬液进行细胞计数。

(2)使用新鲜配制的冻存液悬浮细胞，控制冻存细胞密度。装载冻存管。

(3)超低温冰箱冻存或液氮罐内液氮冻存，记录冻存位置。

[注意事项]

在途时间8-16h内，可将细胞培养物按无菌操作原则，转移到培养箱暂时培养2-4h，超过16h的在途时间，需将细胞培养物培养过夜或培养16h后再做处理。