1．目的

鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验是以微生物为指示生物的遗传毒理学体外试验，遗传学終点是基因突变，用于检测受试物能否引起鼠伤寒沙门氏菌基因组碱基置换或移码突变。本方法规定了地表水和废水的样品采集、预处理的方法和鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验的基本技术要求。

2．原理

鼠伤寒沙门氏菌的标准试验菌株为组氨酸缺陷型突变型，在无组氨酸的培养基上不能生长，在有组氨酸的培养基上可以正常生长。诱变剂（mutagen)，又称为致突变剂或致突变物，可使沙门氏菌组氨酸缺陷突变型回复突变为野生型，在无组氨酸培养基上也能生长。故可根据在无组氨酸的培养基上生成的菌落数量，判断受试物是否为诱变剂。对于间接诱变剂，可用经多氯联苯（PCB）诱导的大鼠肝匀浆制备的S-9混合液作为代谢活化系统。

3．样品的采集

（1)仪器设备条件

采样瓶为棕色、大口玻璃瓶，瓶盖具聚四氟乙烯衬垫，或在样品无腐蚀性条件下使用具铝箔外衬的橡皮塞。

(2）样品采集

用采样瓶手工采集适量样品，地表水和废水样品要完全充满容器，密封，并于2h内送至实验室，尽快进行处理。

4．地表水和废水的样品预处理

（1)仪器设备条件

①分液漏斗。

②贮水器，具下口的玻璃容器。

③树脂柱玻璃管，高不低于10cm，柱管直径与柱长比为1：4-1：10之间。

④输液泵。

⑤旋转蒸发器或KD浓缩器。

⑥高纯氮气。

(2）试剂

①纯水：符合GB6682-1192实验室用水规格。可用去离子水经全玻璃蒸馏器蒸馏制得。

②10mol/L氢氧化钠溶液。

③(1：1)硫酸溶液。

④lmol/L氢氧化钠溶液。

⑤lmol/L盐酸溶液。

⑥二氯甲烷、甲醇、丙酮、正己烷，不低于分析纯级，应在玻璃容器中重蒸馏后方能使用。

⑦二甲基亚砜(DMSO)。

⑧XAD-2树脂或等效的大孔树脂：树脂应经纯水及甲醇漂洗后，在索氏提取器中分别用甲醇、二氯甲烷、正己烷、丙酮提取8h，去除有机物。净化后的树脂浸于甲醇中，置4℃冰箱备用。

(3）样品制备

1)有机物的分离提取：

①有机物分离提取前的样品预处理，将采样瓶于4℃静置24h，使非水液相、水相、
沉积固相分离。水相按下述原则处理：地表水中悬浮物的量低于5％时可直接进行有机物的大孔树脂提取；悬浮物的量高于5％地表水及废水进行有机物的液一液提取。

②有机物的液一液提取：取二份1500m1的水样分放到二个2000ml分液漏斗中。用10mol/L氢氧化钠将pH值调至11。向每个分液漏斗中加入150m1二氯甲烷，振荡2min，注意放气。静置至少10min，使有机相与水相分层，分出有机相。再各用100m1二氯甲烷提取二次。将三次提取液合并在l000ml烧瓶中。如有机相与水相间的乳化层多于溶剂层的1/3，可离心以达到两相的分层。用（1：1）硫酸溶液将水相的pH值调至2以下。用二氯甲烷150ml、100m1、l00ml分三次进行溶剂提取。将这三次提取的有机相也并入1000m1烧瓶中。

③有机物的大孔树脂分离提取：将净化后的树脂连同丙酮一起装入树脂柱，树脂上、下端分别垫、盖玻璃棉。排去柱中丙酮，用纯水洗柱三次（注意每次不能把试剂排空）。使水样流经树脂柱，流速为1-2倍柱体积／min，水样量不超2000倍柱体积，用真空泵抽去柱中水，然后用4-8倍柱体积85：15的正己烷、丙酮和8个柱体积二氯甲烷分别三次浸柱以洗脱有机物。浸泡时间为每次10min。然后缓缓滴流，将洗脱液收集至烧瓶中。

④提取液浓缩：使用旋转蒸发器或KD浓缩器，将获取的提取液或洗脱液浓缩。浓缩液50％供重量分析或化学分析，余50％继续浓缩至lml。

⑤溶剂置换：于40℃水浴，用氮气流将浓缩的提取液吹干。加入适量DMSO溶解提取物，并稀释备用。

⑥样品量计算结果的表示：样品预处理所得水相体积或经树脂柱水样的体积以L表示。有机提取物的重量以mg表示。结果应换算至原水的水样量。

5.鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验

（1)仪器设备

洁净工作台，恒温培养箱，恒温水浴，蒸汽压力锅，匀浆器等实验室常用设备。低温高速离心机，低温冰箱（-80℃）或液氮罐。

(2）培养基制备

除说明外，培养基成分或试剂应是化学纯或分析纯。避免重复高温处理，注意保存温度和期限。

1)营养肉汤培养基：用作增菌培养。

牛肉膏2.5g

胰胨（或混合蛋白胨）5.0g

氯化钠2.5g

磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O)1.3g

蒸馏水至500ml

加热溶解，调pH值至7.4，分装后0.103MPa灭菌20min,4℃保存，保存期不超过6个月。

2)营养肉汤琼脂培养基：用作基因型（rfa突变，R因子，pAQ1质粒，AuvrB）鉴定。

琼脂粉1.5g

营养肉汤培养基l00ml

加热融化后调pH值为7.4,0.103MPa灭菌20min。

3）底层培养基，用于致突变试验。

①V-B盐贮备液，50×

磷酸氢钠铵(NaNH4HPO4)17.5g

柠檬酸（C6H8O7·H2O)l0.0g

磷酸氢二钾（K2BPO4)50.0g

硫酸镁（MgSO4·7H2O)1.0g

加蒸馏水至100ml,0.103MPa灭菌20min。

待其他试剂完全溶解后，再将硫酸镁缓慢放入其中继续溶解，否则易析出沉淀。

②40％葡萄糖溶液：

葡萄糖40.0g

加蒸馏水至100ml,0.055MPa灭菌20min。

③1.5％琼脂培养基：

琼脂粉15g

蒸馏水930m1

融化后0.103MPa灭菌20min。趁热（80℃），以无菌操作加入：

V-B盐贮备液，50×20m1

40%葡萄糖溶液50m1

充分混匀，待凉至50℃左右时倒入培养皿，每皿（φ90mm)25m1,37℃培养过夜，以除去水分及检查有无污染。

4）顶层培养基。

①顶层琼脂：

琼脂粉0.6g

氯化钠0.5g

加蒸馏水至100m100.103MPa灭菌20min。

②0.5mmol/L组氨酸一生物素溶液：

D-生物素（分子量244)30.5mg

L-盐酸组氨酸（MW191.17)23.9mg

加蒸馏水至250ml,0.103MPa灭菌20min。

顶层培养基制备：加热融化顶层琼脂，每l00ml顶层琼脂中加0.5mmol/L组氨酸一生物素溶液10ml。混匀，分装于灭菌试管，每管2ml，在45℃水浴中保温。

5）鉴定菌株基因型用试剂：

①0.8%氨节青霉素溶液（无菌配制）：称取氨节青霉素40mg，用0.02mol/L氢氧化钠溶液5m1溶解，保存于4℃冰箱。

②0.8％四环素溶液（无菌配制）：称取40mg四环素，用0.02mol/L盐酸5m1溶解，保存于4℃冰箱。

③0.1％结晶紫溶液：称取结晶紫l0mg,溶于loml灭菌蒸馏水。

④组氨酸-D-生物素平板：

l.5％琼脂培养基914ml

V-B盐贮备液20m1

40%葡萄糖溶液50ml

L-盐酸组氨酸（(0.4043g/100ml)10m1

D-生物素溶液（0.02mol/L)6m1

分别灭菌后，全部合并（(1000ml)，充分混匀，待凉至50℃左右时倒平皿。

6)氨节青霉素平板（保存TA97,TA98,TA100菌株的主平板）；氨苄青霉素一四环素平板（保存TA102菌株的主平板）。

1.5％琼脂培养基914ml

V-B盐贮备液，50×20ml

40%葡萄糖溶液50ml

L-盐酸组氨酸（(0.4043g/100m1）l0ml

D-生物素溶液（(0.02mol/L)6ml

0.8%氨节青霉素溶液3.15ml

0.8％四环素溶液0.25ml（氨节青霉素-四环素平板）

分别灭菌或无菌制备，注入l000ml瓶中，充分混匀，待凉至50℃左右时倒平皿。

(3)代谢活化系统的制备

1)大鼠肝S-9的诱导和制备：选健康雄性成年SD或Wistar大鼠，体重150g左右，周龄约5-6周。将多氯联苯（Aroclor1254或国产五氯联苯）溶于玉米油中，浓度为200mg/ml，按500mg/kg体重一次腹腔注射，5d后断头处死动物，取出肝脏称重后，用在4℃预冷的0.15mol/L氯化钾溶液冲洗肝脏数次。每克肝（湿重）加预冷的0.15mol/L氯化钾溶液3m1，用消毒后的医用剪刀剪碎肝脏，用匀浆器（低于4000r/min,1-2min)在冰浴中制成肝匀浆。以上操作需注意无菌和局部4℃冷环境。

将肝匀浆在低温0-4℃高速离心机，12000r/min离心10min。吸出上清液为S-9组分，分装。保存于液氮或-80℃低温。S9应经无菌检查，蛋白含量测定（Lowry法）及间接诱变剂鉴定其生物活性合格。

2)S-9混合液的配制：

①0.4mol/L氯化镁-1.65mol/L氯化钾：称取MgC12·6H2O8.1g,KCl12.3g加蒸馏水稀释至100m1。0.103Mpa20min灭菌或过滤除菌。

②0.2mo1/L磷酸盐缓冲液（pH7.4)，每500m1由以下成分组成：

磷酸氢二钠（Na2HPO414.2g/500ml)440ml

磷酸二氢钠（NaH2PO4·H2O13.8g/500ml)60m1

调pH值至7.4,0.103Mpa20min灭菌或过滤除菌。

③10%S9混合液的配制：每10ml由以下成分组成，临用时配制。

灭菌蒸馏水3.8m1

磷酸盐缓冲液（(0.2mo1/L,pH7.4)5.0m1

1.65mo1/L氯化钾-0.4mol/L氯化镁溶液0.2m1

葡萄糖-6-磷酸钠（MW305.9,0.05mo1/L)40μmo1

辅酶11(MW765.4,0.05mol/L)50μmo1

肝S9液1.0m1

混匀，置冰浴待用。在4℃以下，其活性可保存4-5h。当日使用，剩余的S-9混合液废弃。

(4）受试生物

1)试验菌株：采用四株鼠伤寒沙门氏突变型菌株TA97、TA98、TA100和TA102。TA97、TA98可检测移码型诱变剂；TA100可检测碱基置换型诱变剂；TA102检测移码型和碱基置换型诱变剂。

2)增菌培养：取灭菌的25m1三角烧瓶，加入营养肉汤l0ml，从试验菌株母板上刮取少量细菌，接种至肉汤中。37℃振荡培养10h，存活细菌密度可达（(1-2)×109/m1。

(5）菌株鉴定和保存

四种标准试验菌株必须进行基因型鉴定、自发回变数鉴定，以及对鉴别性诱变剂的反应的鉴定，合格后才能用于致突变试验。

1)菌株基因型鉴定：

①组氨酸营养缺陷鉴定（组氨酸需求试验）：加热融化底层培养基两瓶各l00ml。一瓶l00ml加L-盐酸组氨酸溶液（0.50g/100ml)lml和D-生物素溶液（0.5mmol/L)0.6ml;一瓶l00ml加D-生物素溶液（0.5mmol/L)0.6m1。充分混匀，待凉至50℃左右时各倒平皿四块，即分别为组氨酸一生物素平板和生物素平板。取组氨酸一生物素平板和生物素平板各一块，将试验菌株在此两组培养基上划线接种，经37℃培养24-48h，观察生长情况。此四种菌株应在组氨酸一生物素平板上生长，而在无组氨酸的生物素平板上不能生长。

②深粗糙型（rfa）鉴定（结晶紫抑菌试验）：深粗糙型突变的细菌，缺失脂多糖屏障，因此分子量较大的物质能进入菌体。

鉴定方法：用移液器吸0.1％结晶紫溶液20μl，在肉汤平板表面涂成一条带，待结晶紫溶液干后，在与结晶紫带方向垂直划线接种四种试验菌株。经37℃培养24-48h，观察生长情况。此四种菌株在结晶紫溶液渗透区出现抑菌，证明试验菌株有rfa突变。

③uvrB缺失的鉴定（紫外线敏感试验）：uvrB缺失即切除修复系统缺失。

鉴定方法：取受试菌液在营养肉汤琼脂平板上划线。用黑纸覆盖培养皿的一半，然后在15W的紫外线灭菌灯下，距离33cm照射8s。37℃培养24h。对紫外线敏感的三个菌株(TA97、TA98、TA100）仅在没有照射过的一半生长，而菌株TA102在没有照射过的一半和照射过的一半均能生长。

④R因子和pAQ1质粒的鉴定：四个试验标准菌株均带有R因子，具有抗氨苄青霉素的特性。TA102菌株含pAQ1质粒具有抗四环素的特性。

用结晶紫抑菌试验的方法，在二个肉汤平板上分别滴加氨节青霉素溶液20μl（浓度为lmg/ml,溶于0.02mol/LNaOH）和四环素溶液20μl（浓度为0.08mg/ml，溶于0.02mol/LHCl)，并在肉汤平板表面涂成一条带，待溶液千后，垂直划线接种四种试验菌株。经37℃培养24-48h，观察生长情况。四个菌株生长应不受氨苄青霉素抑制，证明它们都带有R因子。TA102菌株生长应不受四环素抑制，证明带有pAQ1质粒。

2)自发回变数测定：取已融化并在45℃水浴中保温的顶层培养基一管（2ml)，加入测试菌菌液0.1m1，迅速混匀，倒在底层培养基上，转动平皿使顶层培养基均匀分布在底层上，平放固化。翻转平板于37℃培养48h，观察结果。计数回变菌落数。每株的自发回变率应落在表5-4-1所列正常范围内。

3）对鉴别性诱变剂的反应：试验菌株对不同诱变剂的反应不同，应该在有和没有代谢活化的条件下鉴定各试验菌株对诱变剂的反应。可按下述的点试验或平皿掺入试验的方法进行。

4）菌株保存：

①鉴定合格的菌种应加入DMSO作为冷冻保护剂，保存在-80℃或液氮（-196℃),或者冰冻干燥制成干粉，4℃保存。

②主平板保存：作主平板保存时，将菌落划线接种于主平板上，孵育24h后保存于4℃
冰箱中。TA97、TA98、TA100菌株保存在氨节青霉素主平板上，可使用二个月。TA102菌株的氨节青霉素一四环素主平板上，可保存二周。应按时从保存的主平板上移菌，制备新的主平板。

(6）试验程序

1)实验设计：受试物最低剂量为每平皿0.1μg，最高剂量为5mg，或出现沉淀的剂量，
或对细菌产生最小毒性剂量。一般选用4-5个剂量，进行剂量一反应关系研究，每个剂量应有三个平行平板。溶剂可选用水、二甲基亚砜（每皿不超过0.4ml）或其他溶剂。每次实验应有同时进行的阳性对照和阴性（溶剂）对照。

2）方法和步骤：实验方法有平板掺入法和点试法。一般先用点试法作预试验，以了解受试物对沙门氏菌的毒性和可能的致突变性，平板掺入法是标准试验方法。

①平板掺入法：在底层培养平皿上写上记号。取已融化并在45℃水浴中保温的顶层培养基一管（2ml)，依次加入受试物溶液0.1m1，测试菌菌液0.05-0.2m1（需活化时加10%S-9混合液0.5m1)，迅速混匀，倒在底层培养基上，转动平皿使顶层培养基均匀分布在底层上。平放固化后，将平板翻转，置37℃培养48h观察结果。

②点试法：在底层培养平皿上写上记号。取己融化并在45℃水浴中保温的顶层培养基一管（2ml)，加入测试菌菌液0.05-0.2ml（需活化时加10%S-9混合液0.5ml)，迅速混匀，倒在底层培养基上，倾斜平皿使顶层培养基均匀分布在底层上，平放固化。取无菌滤纸圆片（直径6mm)，小心放在已固化的顶层培养基的适当位置上，用移液器取适量受试物（如10μl），点在纸片上，或将少量固体受试物结晶加到纸上或琼脂表面，将平板翻转，置37℃培养48h观察结果。

6．质量保证
应对水样预处理和鼠伤寒沙门氏菌致突变试验进行质量控制。

①设置阴性对照，即用纯水代替水样，完成样品制备全过程。用所得浓缩物作为阴性溶剂对照。

②设置阳性对照，用适当剂量的阳性对照物经历样品制备全过程。

③致突变试验标准菌株应鉴定合格，实验应设置平行样。

7．数据与报告

（1)数据处理

结果以均数士标准差表达。利用适当的统计学方法处理数据。

(2）结果评价

①点试法：凡在点样纸片周围长出一圈密集的his+回变菌落者，该受试物即为诱变剂。
如只在平板上出现少数散在的自发回变菌落，则为阴性。如在滤纸片周围见到抑菌圈，说明受试物具有细菌毒性。

②掺入法计数培养基上的回变菌落数。如在背景生长良好条件下，受试物每皿回变菌落数等于或大于阴性对照数的2倍，并有剂量一反应关系；或至少某一测试点有重复的并有统计学意义的阳性反应，即可认为该受试物对鼠伤寒沙门氏菌有致突变性。当受试物浓度达到抑菌浓度或5mg/皿仍为阴性者，可认为是阴性。

③报告的试验结果应是两次以上独立实验的重复的结果。如果受试物对四种菌株（加和不加S-9)的平皿掺入试验均得到阴性结果，可认为此受试物对鼠伤寒沙门氏菌无致突变性。如受试物对一种或多种菌株（加或不加S-9)的平皿掺入试验得到阳性结果，即认为此受试物是鼠伤寒沙门氏菌的致突变物。

(3）试验的解释和评价

①细菌回复突变试验利用原核细胞，在某些方面不同于哺乳动物细胞，如摄取、代谢、染色体结构和DNA修复过程。本试验的体外代谢活化系统不可能完全模拟哺乳动物体内代谢条件。因此本试验对受试物在哺乳动物致突变性和致癌性强度不提供直接的资料。

②虽然在本试验为阳性结果的化合物很多是哺乳动物致癌物，但其相关并不是绝对的，取决于化学物类别。有些在本试验未能检出阳性结果的致癌物，是因为经非遗传毒性机制或细菌缺乏的机制引起致癌作用的。

③本试验通常用于遗传毒性的初步筛选，并且，特别适用于诱发点突变的筛选。已有的数据库证明在本试验为阳性结果的很多化学物在其他试验也显示致突变活性。也有一些诱变剂在本试验不能检测，这可能是由于检测终点的特殊性、代谢活化的差别等。另一方面，增强本试验的敏感性可能导致高估了受试物的致突变活性。

(4）试验报告

试验报告必须包括下列资料。

①受试物：水样采集地点，采样日期和时间，气象条件，水样外观，水样预处理方法和过程，受试物浓度。

②溶剂／赋形剂：溶剂／赋形剂选择依据；受试物在溶剂／赋形剂中的溶解性和稳定性（如已知）。

③菌株：所用菌株；每个培养物细胞数；菌株特性。

④试验条件：每平板受试物的量（mg/平板或四平板），剂量选择的依据，每个剂量的平板数；所用培养基；代谢活化系统的种类和组成，包括合格的标准；处理方法。

⑤结果：毒性；沉淀；各平板计数；每平板回变落均数和标准差；剂量一反应关系（如可能）；统计学分析（如有）；同时进行的阴性（溶剂／赋形剂）和阳性对照资料，包括范围、均数和标准差；历史性阴性（溶剂／赋形剂）和阳性对照资料，包括范围、均数和标准差。

⑥结果的讨论。

⑦结论。

8．安全措施与废弃物处理

①应有专门的实验室，应有良好的通风设备。

②由于对样品制备中涉及的毒性与致癌性不完全清楚，应将其按有潜在健康危害的物质对待，试验者必须注意个人防护，尽量减少接触污染的机会。

③受试的致癌物与诱变剂的废弃处理，原则上按放射性同位素废弃物处理方法进行。

④所用沙门氏菌试验菌株一般毒性较低，具有R因子的危害更小。但要防止沙门氏菌污染动物饲养室。