细菌总数测定是测定水中需氧菌、兼性厌氧菌和异养菌密度的方法。因为细菌能以单独个体、成双成对、链状、成簇等形式存在，而且没有任何单独一种培养基能满足一个水样中所有细菌的生理要求。所以，由此法所得的菌落可能要低于真正存在的活细菌的总数。实际上是指lml水样在营养琼脂培养基中，于37℃培养24h后，所生长细菌菌落的总数。此法主要作为判定饮用水、水源水、地表水等污染程度的标志。

（一）培养基

蛋白胨 l0g

牛肉浸膏3g

氯化钠 5g

琼脂． 15-20g

蒸馏水 l000ml

将上述成分混合后，调节pH为7.4-7.6，过滤除去沉淀，分装于玻璃容器中，经121℃高压蒸汽灭菌15min,贮存于暗处备用。

（二）水样的稀释

1. 选择稀释度

稀释度要选择适宜，以期在平皿上的菌落总数介于30-300之间。例如，如果认为直接水样的标准平皿计数可高达3000，就应该将水样稀释到1：100后，再进行平皿计数。
大多数饮用水水样，未经稀释直接接种1 ml，所得的菌落总数可适于计数。

2．水样的稀释方法

①将水样用力振摇20-25次，使可能存在的细菌凝团成分散状。

②以无菌操作方法吸取l0ml充分混匀的水样，注入盛有90m1灭菌水的三角烧瓶中（可放有适量的玻璃珠）混匀成1：10稀释液。

③吸取1：10的稀释液1 ml注入盛9m1灭菌水的试管中，混匀成1:100稀释液。按同法依次稀释成1：1000, 1：10000稀释液（稀释倍数按水样污浊程度而定）。注意：吸取不同浓度的稀释液时，必须更换吸管。也可按图5-2-3所示的方法进行稀释。

（三）操作方法

①以无菌操作方法用lrnl灭菌吸管吸取充分混匀的水样或2-3个适宜浓度的稀释水样1 ml，注入灭菌平皿中，倾注约15ml已融化并冷却到45℃左右的营养琼脂培养基，并立即旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀。每个水样应倾注两个平皿，每次检验时，另用一个平皿只倾注营养琼脂培养基作空白对照。

②待琼脂冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于37℃恒温箱内培养24h，进行菌落计数。

（四）菌落计数

培养之后，立即进行平皿菌落计数。如果计数必须暂缓进行，平皿需存放于5-10℃冰箱内，且不得超过24h。但是不可以使这种做法成为常规的操作方式。作平皿菌落计数时，可用菌落计数器或放大镜检查，以防遗漏，在记下各平皿的菌落数后，应求出同稀释度的平均菌落数。在求同稀释度的平均数时，如果其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的菌落数。若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，则可将此半皿计数后乘以2代表全皿菌落数，然后再求该稀释度的平均菌落数。如果由于稀释等过程中有杂菌污染，或者对照平皿显示出培养基或其他材料染有杂菌，以致平皿无法计数，则应报告“实验事故”。

对那些看来相似，距离相近但却不相触的菌落，只要它们之间的距离不小于最小菌落的直径，便应一一予以计数。那些紧密接触而外观（例如形态或颜色）相异的菌落，也应该一一予以计数。

（五）计算和报告计数结果

细菌总数是以每个平皿菌落的总数或平均数（例如同一稀释度两个重复平皿的平均数）乘以稀释倍数而得来的。各种不同情况的计算方法如下：

①首先选择平均菌落数在30^300之间者进行计算，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即以该平均菌落数乘其稀释倍数报告。

②若有两个稀释度，其平均菌落数均在30-300之间，则应按二者之比值来决定。若其比值小于2应报告两者的平均数，若大于2则报告其中较小的数值。

③若所有的稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释倍数最大的平均菌落数乘以稀释倍数报告。

④若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释倍数最小的平均菌落数乘以稀释倍数报告。

⑤若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间，则以最接近300或30的平均菌落数乘稀释倍数报告。

⑥菌落计数的报告；菌落数在100以内时按实有数报告；大于100时，采用二位有效数字，用10的指数来表示。在报告菌落数为“无法计数”时，应注明水样的稀释度。