一、目的和要求

(1) 了解梨形四膜虫生长的基本条件、遗传特性及原生动物致突变实验法的原理。

(2）掌握实验方法。

二、原理

梨形四膜虫(Tetrahymena pyriformis）是原生动物是的代表种之一，属原生动物纤毛虫纲、膜口目、四膜虫科，广泛分布于世界各地的淡水中，是组成水生食物链的广阔基础之一。其生活周期短（代时仅为2-4h)，生长快速，易于在无菌条件下纯培养形成无性克隆（(clone)，并能被诱导同步化生长，它比细菌更接近高等生物。梨形四膜虫具有典型的真核生物的细胞器，它的代谢功能与哺乳动物的肾和肝脏非常类似，具有整体动物生命的一些代谢功能，能对外界压力做出敏感的反应，它们对环境的反应比原核生物更加显著。梨形四膜虫还具有一种特殊构造，称为刺泡（trichocyst)，它们垂直细胞外侧排列。一般1个四膜虫大约有1500个刺泡。外界刺激（如化学物质、电刺激等）可使其发射出具有保护性的、细长的刺丝。对放射性和化学诱变剂敏感，可诱导刺泡发生突变，刺泡突变是基因突变，有6个基因作用在9个遗传位点上，突变后，形态有所改变，呈现球形、椭圆形、棒形。在细胞内位置有相应的变化，影响细胞的发射功能。本实验以刺泡发射障碍为实验终点，检测环境因子的诱变性及其诱变程度，评价环境污染物的潜在危害。

三、仪器与试荆

(1) 生物显微镜。

(2) 显微照相设备。

(3）浮生生物计数框。

(4) 25mL比色管。

(5）培养液。

胰蛋白陈                              10-20g

葡萄糖（分析纯）                      5g

去离子水                          加至1000mL

调节pH至7.2，经51b/in215min高压灭菌后置冰箱备用。

(6) Lugol's液。

KI                                    60g

I2（结晶）                         40g

蒸馏水                          加至1000mL

(7) lmol/L NaOH溶液。

(8）受试物。根据实验目的而定。

(9) 实验生物。纯培养的S1上海梨形四膜虫无性生殖克隆，由上海华东师范大学生物学系提供。

四、实验步骤

1．四膜虫的增殖培养和生长曲线制备

以无菌操作取0. 0lmL四膜虫液（约20个虫体），放入盛有100mL无菌培养液的三角烧瓶中，在27℃中，以100-150r/min振荡培养，找出四膜虫生长、繁殖最旺盛期。每隔12h取培养虫液，滴加Lugol's液杀死细胞，在显微镜下测定虫口密度。以虫口密度和培养天数作生长曲线图。斜率最大的天数即为最旺盛期，即对数期。以此期细胞备用。

2．受试物浓度的选择

经预备实验获得急性毒性实验结果，以最小致死浓度为最高剂量，制成5个等对数间距的浓度组。以培养液作空白对照组，每个浓度设3个平行样。

3．致突变试验

(1) 吸取不同浓度的受试物0. 1mL，加入含有9. 8mL培养液的25mL比色管中。

(2）无菌条件下吸取0. 1mL处于对数生长期的四膜虫液于各比色管中，充分摇匀，置恒温培养箱中于27℃培养48-96h。

(3）每隔12-24h取0. 1 mL四膜虫培养液，在0. 1mL浮游生物计数框内用显微镜观察活体细胞，然后滴加Lugol's液固定，计数刺泡突变细胞数目。

(4）取典型刺泡突变的四膜虫体进行制片、染色、显微镜照相。

五、数据处理

1．结果与表示

(1) 计算刺泡突变数。

(2) 计算刺泡突变率。

刺泡突变率（％）＝浓度组刺泡突变率（％）一对照组刺泡突变率（％）

2．处理与评价

以刺泡突变率对浓度对数绘图，求出相关系数r及回归方程。

六、注意事项

(1）实验中应严格无菌操作，控制湿度和pH。

(2）在接种虫体培养和取样观察与计数时均要摇匀，以达到均匀取样，减少实验中的误差。