一、目的和要求

(1) 掌握双波长法与导数光谱测定混合物的基本原理。

(2) 熟悉岛津UV2201分光光度仪的操作步骤。

二、原理

用经典的分光光度法测定浑浊或背景吸收大的试样时，操作手续烦琐，测定误差较大；分别测定多组分试样的各个组分时，遇到许多困难。采用双波长或导数光谱分析技术，能从分析波长的信号中除去来自参比波长的信号，消除试样的散射、其他物质的干扰及光源的波动等不利因素，有利于提高方法的灵敏度和选择性，同时简化了分析手续，扩大应用范围。

1．双波长法

根据朗伯一比尔定律：

-1g＝Ⅰ_λ/Ⅰ₀=Aλ=Eλcb （1）

式中：Iλ——在波长入出射光强度；

I0——入射光强度；

Aλ——吸收值；

Eλ——化合物在波长λ的摩尔吸收系数；

c——化合物的物质的量浓度；

b——吸收池长度。

如果有两束单色光I1和I2（入射强度I0相等），交替地照射在样品池，则样品在波长久：与λ1处的吸收值分别为

-1g（Ⅰ_λ1/Ⅰ₀ )=A_λ1=E_λ1cb (2)

-1g(Ⅰ_λ2/Ⅰ₀ )=Aλ2=E_λ2cb (3)

以式（3)一式（(2)，则得

-1g(Ⅰ_λ2/Ⅰ_λ1 )=A_λ2-A_λ1=(E_λ2-E_λ1)cb (4)

对于一个确定的组分，其Eλ2、Eλ1是固定的，从式（4)可知，ΔA=-Aλ1的值与组分的浓度成正比，这也就是双波长的定量基础。

在苯酚与三氯苯酚共存的情况下，用普通的分光光度法难以测定苯酚和三氯苯酚的含量。但用双波长法可分别测定苯酚和三氯苯酚，如在λ2、λ1测吸收值，求得△A用于苯酚的测定，λ’2、λ’1另测吸收值，求得△A’，用于三氯苯酚的测定。

2．导数光谱法

导数光谱法与普通分光光度法不同，它不是测定试液的吸光度（A)，而是测定吸光度对波长的导数输出信号（dnA /dλn )。根据朗伯一比尔定律：

A= Ecb (1 ’)

dA /dλ= (dE/dλ)cb (2'）

在较短的波长内，可以Δλ替代dλ则有

△A/Δλ=(ΔE/Δλ)cb (3'）

ΔA= ΔEcb (4 ')

当有背景干扰吸收时，背景吸收几乎不随λ改变而变化，而待测组分则有ΔA，因而可以消除干扰，在双组分和多组分的测定时，同样也可以用导数光谱法。在测定某组分时，选择其△A/Δλ值最大处或较大处，而其他组分的△A/Δλ接近零，图1-17-2是苯酚的一阶导数，从图1-17-2可知，在220nm波长处，可利用一阶导数测定苯酚，而在231 nm处可测定其他共存物质，苯酚无明显干扰。

导数光谱虽然可以用手动计算获得，但较费时，一般是在较先进的全自动分光光度计上用计算程序直接获得数据和导数曲线，从而进行定量分析。

3．在环境检浏和环境科学研究中的应用

工业废水中常含有两种或两种以上的组分，有时需要分别测定它们的含量。例如，苯酚和2,4-二硝基苯酚，在生产上前者是中间体，后者是产品。后者的环境毒性远比前者大。

由于苯酚和2,4-二硝基苯酚的UV光谱有较大的差异，因此可应用双波长法或导数光谱法分别测定它们在工业废水中的含量。

在环境科学领域内，经常研究污染物的降解反应，降解物的光谱往往有别于污染物自身的光谱，所以，双波长法和导数光谱法经常用于降解速率的研究。

三、仪器与试剂

(1) 岛津L V2201型（或其他型号自动扫描及手动分析）紫外一可见分光光度计。

(2）苯酚标准储备液（(25mg/l00mL水溶液）。

(3) 2,4-二硝基苯酚标准储备液（25mg/100mL水溶液）。

四、实验步骤

1．配制苯酚和2,4-二硝基苯酚系列标准使用液

吸取适量的苯酚（或2,4-二硝基苯酚）标准储备液，用蒸馏水稀释至标线。

2．仪器操作

(1) 插入系统盘，开启电源，等待主机进入操作系统。

(2）主菜单显示在荧屏上，选择“Spectrum'，进入。

(3）继续选“Measurement'，进行光谱扫描或选“Data processing”进行数据处理。

(4）大多数操作是通过荧屏底边的提示符指引进行的。一般地，荧屏底边有5条提示，从左到右分别对应于键盘上的“Fl"、"F2"、"F3"、"F4”和“F5"。

(5) 双波长的选择，在谱图上用Zoom线标寻找；导数光谱进入“Data processing”中执行。

(6) 岛津UV2201型分光光度计还有许多功能，学生应根据菜单和提示符并按照老师的指导进行操作。

3．双波长法

(1) 绘制苯酚和2,4-二硝基苯酚标准液的UV吸收曲线，根据它们的吸收波长，找出适宜各自的λ2 (-231nm)、λ1(-330nm或-410nm）和λ2’(-350nm)、λ1’（当干扰物质的吸收值很低时，此波长可以忽略）。

(2）测定苯酚系列标准溶液在λ2 、λ1处的吸收值，求得ΔA可用于苯酚的工作曲线的绘制；同时，测定2,4-二硝基苯酚在λ2’、λ1’处的吸收值，求得ΔA’可用于2,4-二硝基苯酚的工作曲线的绘制。

(3）测定未知样品。

(4）未知样品的A值应为0.3-2，如A值大于2，则应适当稀释，在λ2 、λ1处测定吸收值，求得ΔA用于苯酚的定量；在λ2’、λ1’处测定吸收值，求得ΔA’用于2,4-二硝基苯酚的定量。

4．导数光谱法

(1) 根据苯酚和2,4-二硝基苯酚标准液的UV吸收曲线，在岛津UV2201型分光光度计上绘制它们的导数光谱曲线。找出适宜各自的定量测定的波长段（苯酚，-263nm/210nm; 2，4-二硝基苯酚，-330nm)。

(2) 测定苯酚系列标准溶液在以波段的△A用于苯酚的工作曲线的绘制；同时，测定2,4-二硝基苯酚在Δλ波段的△A’用于2,4-二硝基苯酚的工作曲线的绘制。

(3）测定未知样品。

(4）未知样品的A值应为0.3-2，如A值大于2，则应适当稀释，测定在Δλ波段内的△A，根据苯酚的导数光谱工作曲线求得样品中苯酚的含量；测定在Δλ’波段内的△A’，根据2,4-二硝基苯酚的导数光谱工作曲线求得样品中二硝基苯酚的含量。

五、数据处理

c（苯酚，水样）=c（苯酚，标样）×（ΔA/ ΔA标）

c（2,4-二硝基苯酚，水样）=c（2,4-二硝基苯酚，标样）×（ΔA’/ ΔA标）

六、注意事项

(1) 双波长法或导数光谱法可用于同时测定水样中两种物质，也可用于排除干扰测定某一种物质，但被测物质的浓度引起的光吸收不应太低，或两种物质在选定的波长吸收相差很大。

(2）双波长法应尽量寻找两个波长，其中一个是某一组分吸收峰值，另一个是另一组分的吸收峰值，两个波长之间至少是某一组分吸收值变化较小的区间。