周严严1，赵睁睁1，2，郭小藤1，容蓉1，吕青涛1，巩丽丽1，杨勇1

(1.山东中医药大学药学院，济南250355；2.寿光市中医医院，山东潍坊262700）

摘要利用HPLC指纹图谱研究大鼠灌服芎汤活血有效部位前后尿和粪便样品，并计算特征峰欧式距离，考察粪、尿中药物多成分累积排泄的总体变化趋势。将芎汤有效部位给SD大鼠灌胃后，总体成分在尿样中于8～12h达到排泄高峰，在粪样中于12～24 h达到排泄高峰。采用指纹图谱技术测定排泄物中多成分的排泄曲线，可以更好地阐明中药复方排泄规律。

关键词芎汤；活血有效部位；HPLC指纹图谱；排泄规律；欧氏距离

中药复方芎䓖汤出自《千金方》［1］，由当归和川芎等组成，具有养荣活血的功效［2］，主治妊娠伤胎、包衣不下、难产等证。当归、川芎合用为临床常用补血活血药对［3］。当归和川芎存在共同的有效成分，如藁本内酯、阿魏酸等。此外当归中还有当归多糖、挥发油、氨基酸、微量元素等［4–5］；川芎中还有生物碱、川芎嗪、酚类物质、有机酸、苯酞内酯及其它成分［6］。由于中药及复方成分的复杂性，中药复方代谢规律的研究一直是个难点。目前的探究主要是针对其中一种或几种活性成分，研究其在体内的药
代动力学及代谢规律。中药复方的药效作用是多成分协同作用的结果，故对芎汤活血有效部位排泄规律的研究，亦应针对多成分考察其总体排泄趋势。指纹图谱技术能较全面地反映中药整体化学特征［7］，测定给药动物排泄物的HPLC指纹图谱，将有助于掌握中药多成分的排泄信息。欧氏距离对于化学指纹图谱相似性具有较好的综合评价能力［8］。前
期研究发现，芎汤大孔树脂分离制备的40%乙醇洗脱部位（40% Ethanol Elution Part，简称EE40部位）中有效成分阿魏酸含量高［9］，该部位可增强红细胞膜的流动性，改善急性期缺血的能量代谢障碍的状态，防止心肌的进一步坏死，是芎汤主要活血有效部位［10］。笔者采用HPLC指纹图谱技术，测定芎䓖汤活血有效部位（EE40部位）给药前后大鼠尿
样、粪样多成分的总体变化趋势，以期阐明芎汤活血有效部位在大鼠体内的总体排泄规律。

1实验部分

1.1主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Agilent 1200型，附DAD检测器，四元低压梯度泵，柱温箱，美国安捷伦公司；

数控超声波清洗器：KQ–5200DB型，江苏省昆山市超声仪器有限公司；

CO2超临界萃取仪：Spe-ed SFE型，美国ASI公司；

电子分析天平：（1）FA1004B型，感量为0.1mg，上海越平科学仪器有限公司；（2）AF240型，感量为0.1 mg，瑞士梅特勒公司；

旋转蒸发器：RE–52C型，上海亚荣生化仪器厂；

电动植物粉碎机：DWF–100型，河北省黄骅市科研机械厂；匀浆器：SZ–1型，江苏金坛市国胜仪器厂；

当归、川芎饮片：批号分别为20100821，20100911，济南建联药店；

大孔吸附树脂：D101型，沧州宝恩吸附材料科技有限公司；

阿魏酸对照品：批号为0773–9910，中国药品生物制品检定所；

藁本内酯、洋川芎内酯A、正丁基苯酞对照品：批号分别为110773–200912，110773–201002，110773–201010，成都瑞芬思生物科技有限公司；

甲醇、乙腈：色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；

实验用水为市售纯净水；实验所用其它试剂均为分析纯。

1.2实验动物

SD大鼠：雄性，体重280～300 g，许可证号为SYXK(鲁)2011–0002，山东中医药大学实验动物中心。

1.3实验方法

1.3.1芎汤活血有效部位灌胃溶液的制备

将当归、川芎药材粉碎，过0.85 mm（20目）筛，分别取250 g，混合，加12倍量70%乙醇回流提取3次，每次1.5 h，合并提取液，回收乙醇，浓缩至1 L，制得芎䓖汤醇提液（每毫升溶液相当于0.5 g生药材）。取醇提液，以1∶3（药材质量与树脂体积比）的比例过D101大孔树脂柱，分别用10倍量的水，20%，40%，60%，95%乙醇依次洗脱，收集不同浓度
的乙醇洗脱液，减压回收乙醇，分别浓缩至500 mL（每毫升样品溶液相当于1 g生药材）。前期研究发现芎汤活血有效部位主要集中在40%乙醇洗脱部分。取40%乙醇洗脱部分水浴低温浓缩至近干，加少许吐温80，用水溶解，超声使之分散均匀，定容至100 mL，得芎汤活血有效部位灌胃药液［8］（相当于原药材5 g／mL）。

1.3.2色谱条件

色谱柱：ZORBAX SB–C18 柱（250 mm×4.6mm，5 μm）；流动相：乙腈–0.5%乙酸混合液，流量为1.0 mL／min；进样体积：20 μL；柱温：35℃；

检测波长：292 nm；参比波长：360 nm。

流动相梯度洗脱步骤见表1。

1.4大鼠尿、粪样品采集与处理

1.4.1灌胃给药

将SD大鼠12只置于代谢笼中，收集空白尿样和空白粪样；实验前禁食（不禁水）12 h，取芎汤活血有效部位灌胃药液，以40 g／kg的剂量灌胃给药，收集给药后0～4 h，4～8 h，8～12 h，12～24 h，24～36h，36～48 h，48～60 h，60～72 h，72～84 h，84～96 h各时间段的尿样和粪样。尿样记录体积，粪样称重，于–20℃冷冻保存。

1.4.2尿样处理

取尿样400 μL，甲醇200 μL，乙睛1 mL，涡流30 s，以4 000 r／min转速离心10 min，取上清液1 mL，浓缩至干，加甲醇100 μL，溶解，以10 000 r／min转速高速离心，取上清液。

1.4.3粪样处理

取粪样0.5 g （湿重，总质量不足0.5 g的则全取）于试管中，加入甲醇（粪样重量–甲醇体积之比为1∶4）后匀浆，超声、离心（转速为4 000 r／min）各10 min，取上清液400 μL，加入甲醇200 μL，乙腈1 mL，涡旋30 s，离心（转速为4 000 r／min）10 min，取上清液1 mL，浓缩至干，加甲醇100 μL溶解，以10 000 r／min高速离心，取上清液即得。

1.5实验步骤

提取给药后尿、粪样品的HPLC指纹图谱中峰面积有明显变化的色谱峰和新增的色谱峰作为特征峰，以特征峰面积为指标，计算不同时间段收集的尿样、粪样给药前后HPLC指纹图谱的欧氏距离，考察给药前后不同时间段尿样、粪样的相似性。

2结果与讨论

2.1稳定性及精密度试验

取给药后12～24 h时间段采集的尿样，按照1.4.2方法处理后，在1.3.2色谱条件下进样测定，每隔2 h进样一次，10 h内连续进样5次，考察精密度和样品10 h内的稳定性。选择9个特征指纹峰进行考察，以5号峰为参比峰，各特征峰相对保留时间和特征峰面积为指标进行考察，结果见表2。由表2相关数据得知，特征峰的相对保留时间和峰面积相对标准偏差均小于1%，表明HPLC指纹图谱测定精密度良好，样品在10 h内稳定。

2.2大鼠尿样HPLC指纹图谱

比较EE40部位给药前后不同时间段的大鼠尿样HPLC指纹图谱差异，将按照1.4.2处理所得尿样在1.3.2色谱条件下测定，色谱图见图1、图2。

2.3大鼠粪样HPLC指纹图谱

比较EE40部位给药前后不同时间段的大鼠粪样HPLC指纹图谱差异，将1.4.3处理的粪样样品按1.3.2色谱条件进行测定，色谱图分别见图3、图4。

2.4HPLC指纹图谱数据

EE40部位给药后尿样和粪样HPLC特征峰面积数据见表3、表4。

2.5HPLC指纹图谱数据处理结果

聚类分析是用多元统计技术进行分类的一种方法。目前多维空间里的两样本距离的计算方法主要有欧氏距离、马氏距离、闵氏距离等，其中以欧氏距离最常用。对n个含m个指标的样本，可定义为m维空间的点，在m维空间中的任意两点，其相似性可用“距离”度量，定义为“dij”，若将任一样本看作一类，其类间相似性可用欧氏距离DE表示［11］。

将给药后不同时间段采集的样品作为i样本、给药前样品作为j样本，以HPLC特征峰面积为指标，计算不同时间段收集的尿样、粪样给药前后HPLC指纹图谱的欧氏距离DE，以欧氏距离DE表征各样本指纹图谱间的相似性，考察样本中多成分的总体变化趋势。

式中：l—样本指标数，即特征峰个数l=1，2，3…m；

i，j——样本序号，即不同时间段采集的样本；

xil，xjl——样本各指标，即特征峰面积。

以DE为纵坐标、给药后的取样时间为横坐标绘图，DE数据见表5，尿样、粪样DE与取样时间关系分别见图5、图6。

由图5和图6可知，大鼠EE40部位给药后尿样在8～12 h内有显著变化，表明总体成分的肾脏排泄在此时间段达到高峰，60 h后排泄量很少，96 h基本排泄完全；粪样在12～24 h内有显著变化，证明总体成分的肠道排泄在此时间段达到高峰，72 h后排泄量很少，84 h基本排泄完全。该研究为临床制定更为合理的用药方案提供依据。

3结语

采用欧氏距离综合反映不同时间段给药动物尿样、粪样HPLC指纹图谱多个特征峰的整体变化，更加符合中药整体作用的特点；以色谱峰保留时间和峰面积为指标，通过与给药前空白尿、粪样品指纹图谱比较，发现给药后尿、粪样品的HPLC指纹图谱的色谱峰，部分与给药前样品相同，属内源性成分；部分为新增加的色谱峰，可能来自芎汤活血药效部位的原成分及其代谢产物。这些成分的归属和结构确定有待于进一步研究。

参 考 文 献

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