对羟基苯甲酸酯为常用防腐剂之一，其抑菌范围广、作用强、用量少、毒性低、易配伍且防腐效果不易随pH值的变化而变化，在碱性环境下尚有效，对食品起到保鲜与防腐作用。近年来，对羟基苯甲酸酯类防腐剂被广泛应用于各种食品中，但是大量或不当使用防腐剂会对人体造成一定损害，如有雌激素样作用，影响人的内分泌功能等。因此，中国、加拿大、日本和欧盟等许多国家和国际组织对食品中对羟基苯甲酸酯类防腐剂的使用制定了添加限量。

目前，对羟基苯甲酸酯的测定方法主要有高效液相色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、气相色谱-质谱法和毛细管电泳法等。这些方法多是对一类样品基质中的几种对羟基苯甲酸酯的含量进行测定，适用范围较窄。本研究建立了同时测定蔬菜、水果(经表面处理)、碳酸饮料、牛奶、醋、食品馅料等食品中6种对羟基苯甲酸酯的高效液相色谱-二极管阵列检测器的分析方法。与已报道的文献方法相比，本方法的检出限更低，线性范围更宽，适用于同时测定各种食品基质中6种对羟基苯甲酸酯的含量。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

1200高效液相色谱仪(DAD检测器，美国Agilent公司)；4011 Digital旋转蒸发仪(德国Heidoiph公司)；XH-B型振荡器(江苏康健医疗用品有限公司)；3-30K台式高速冷冻离心机(德国Sigma公司)；IC-C18固相萃取小柱(美国SuPELCo公司)。对羟基苯甲酸(甲、乙、异丙、丙、异丁、丁)酯标准品(纯度≥99.5％，夺Dr.Ehrenstorfer GmbH)；乙腈、甲醇(色谱纯，美国TEDIA公司)；其它试剂均为分析纯；实验用水均为二次蒸馏水。

2.2 样品的提取

称取5.0g样品于50mL离心管中，加人2mL2mol/L乙酸铵缓冲液(pH=6.5)振荡溶解，加入2gNaCl，15 mL乙腈振荡提取，再加入10mL乙腈振荡提取两次，合并提取液于旋蒸瓶中，旋转蒸发至近干，待净化。

2.3 样品的净化

用2mL 35％甲醇溶解上述步骤处理的残渣，并转入已用5 mL甲醇，5 mL水活化的LC-C18固相萃取小柱，用3mL30％甲醇淋洗，5mL5％氨化甲醇洗脱，收集洗脱液，置于40℃氮吹仪上浓缩至干，残渣用2mL甲醇溶解振荡2min，过0.45um微孔滤膜，进行HPLC测定。

2.4 色谱条件

Agilent C18色谱柱(150mmX4.61mm，3.5 pm)；流动相：甲醇和水，梯度洗脱：0～5min，40％甲醇；5～15min，40％～60％甲醇；15～30 min，60％甲醇。流速：0.8 mL/min；柱温：35℃；检测器：二极管阵列检测器；检测波长：260nm；进样量：lOuL。
3 结果与讨论

3.1 色谱条件选择

选择甲醇和水为流动相，等度洗脱始终不能将对羟基苯甲酸丙酯和异丙酯、丁酯和异丁酯有效分离；因此，对梯度洗脱程序进行优化，在2.4节的色谱条件下，6种对羟基苯甲酸酯得到有效分离，且灵敏度较高。6种对羟基苯甲酸酯标准溶液的色谱图见图1。

3.2 提取溶剂的选择

对羟基苯甲酸酯难溶或微溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、乙腈等有机溶剂。本研究对上述几种溶剂的提取效率进行了考察。结果表明，甲醇、乙醇、丙酮、甲醇-乙腈(1:l，V/V)对部分基质的提取效率不高，且提取溶液浑浊，旋蒸过程中易鼓鼓泡，不易操作；乙醚、乙腈对食品中6种对羟基苯甲酸酯的提取效率高，提取溶液清澈，易进行固相萃取净化。国家标准GB/T 5009.31-2003采用乙醚萃取，乙醚沸点低，挥发性强，易燃易爆，且产生大量有机废液，为了能同时预处理多种类的样品基质，并可同时检测6种对羟基苯甲酸酯，本研究选择了干扰较少．回收率和选择性都满足要求的乙腈作为提取溶剂。
3.3 净化方法的选择

3.3.1淋洗液的选择

样品上柱后，有些干扰物质会与被测物一起被吸附，有必要在洗脱被测物前，先淋洗萃取柱去除杂质。在空白样品基质中添加1.0 mg/kg对羟基苯甲酸酯标准溶液．经乙腈提取浓缩后上LC-C18。固相萃取柱，以不同浓度的甲醇作为淋洗液，考察其回收率，结果见表l。结果表明,采用30％甲醇淋洗液．既能有效去除干扰杂质，又不会将目标化合物洗脱，不同淋洗液的液相色谱图见图2。因此，选择30％甲醇作为淋洗液。

3.3.2洗脱液的选择

对不同浓度的氨化甲醇洗脱效果进行了考察，洗脱能力随氨水浓度增大而增强，干扰成分也会增加。从表2可见：用5％氨化甲醇洗脱时，6种对羟基苯甲酸酯均被洗下，回收率均较高，且干扰成分少。因此，选择5％的氨化甲醇为洗脱液。

3.4 线性范围及检出限

在选定色谱条件下测定一系列对羟基苯甲酸(甲、乙、异丙、丙、异丁、丁)酯标准溶液，分别以峰面积对浓度作图。浓度在1.O～500.0 mg/L范围内线性关系良好，r≥0.9997(表3)。以3倍信噪比计算，本方法对对羟基苯甲酸(甲、乙、异丙、丙、异丁、丁)酯的检出限为0．0016～0．0081mg/L。

3.5 样品分析

在优化条件下对不同食品中的6种对羟基苯甲酸酯进行测定，结果表明：蔬菜、水果、碳酸饮料、牛奶、醋、食品馅料等食品中对羟基苯甲酸酯含量均低于添加限量，部分基质的空白样品和加标样品色谱图见图3。对测定的不同样品基质采用标准加入法在3个浓度水平下分别平行测定10次，计算加标回收率在85.1％-95.4％之间，RSD为3.6％～10.9％。实验结果表明，本方法适用于食品中6种对羟基苯甲酸酯含量的测定，具有简便、快速、灵敏度高等优点。