北京普天同创生物科技有限公司
A.9 游离核黄素和核黄素二磷酸盐的测定
A.9.1 试剂和材料
A.9.1.1 KH2PO4溶液:0.054mol/L。
A.9.1.2 甲醇:色谱纯。
A.9.1.3 核黄素标准品:核黄素含量不低于99.0%(质量分数)。
A.9.1.4 核黄素5'-磷酸钠标准品:核黄素含量不低于74.0%(质量分数)。
A.9.2 仪器和设备
高效液相色谱仪,配荧光检测器(激发波长440nm;发射波长470nm)。
A.9.3 参考色谱条件
A.9.3.1 色谱柱:C18柱,3.9mm×300mm,或其他等效的色谱柱。
A.9.3.2 流动相:按K2PO4溶液:甲醇=85:15(体积比)配制,混合均匀后,用0.45um滤膜过滤,超声脱气后备用。
A.9.3.3 柱温:室温。
A.9.3.4 流动相流速:2.0mL/min。
A.9.3.5 进样量:100uL。
A.9.4 分析步骤
A.9.4.1 系统适应性溶液的制备
溶解100mg核黄素5'-磷酸钠标准品于水中,使其质量浓度为2.0mg/mL,加入等体积的流动相,混匀。吸取8mL,用流动相稀释至50mL,混匀备用。
A.9.4.2 标准溶液的制备
精确称取60.0mg核黄素标准品于250mL容量瓶中,小心加入1mL盐酸溶解,用水稀释至刻度,混匀。用移液管吸取4mL的核黄素溶液于100mL容量瓶中,用流动相稀释至刻度,混匀备用。
A.9.4.3 样品溶液的制备
精确称取100.0mg样品于100mL容量瓶中,加50mL水溶解,用流动相稀释至刻度,混匀。用移液管吸取8mL溶液于50mL容量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀备用。
A.9.4.4 系统适应性要求
取适量系统适应性溶液注入色谱仪中进行色谱分析。核黄素4'-单磷酸盐和核黄素5'-单磷酸盐之间的分离度应不低于1.0;核黄素5'-单磷酸盐两次重复进样的相对标准偏差不大于1.5%。
核黄素5'-单磷酸盐的保留时间约为20min~25min。各组分的近似相对保留时间如表A.1所示。
表A.1 各组分的近似相对保留时间
A.9.4.5 测定
分别将等体积(约100uL)的标准溶液、样品溶液和系统适应性溶液注入色谱仪中进行色谱分析,记录色谱图,分别测量标准溶液和样品溶液色谱图中的峰响应值。通过比对系统适应性溶液色谱图中色谱峰的保留时间,确定样品溶液色谱图中待测的峰。
A.9.5 结果计算
游离核黄素含量以游离核黄素的质量分数W3计,数值以%表示,按公式(A.5)计算:
式中:
625—样品的稀释倍数;
Ws—标准溶液中核黄素浓度的数值,单位为毫克每毫升(mg/mL);
PF―样品溶液色谱图中核黄素的峰响应值;
PS—标准溶液色谱图中核黄素的峰响应值;
核黄素二磷酸盐含量以核黄素二磷酸盐的质量分数W4计,数值以%表示,按公式(A.6)计算:
式中:
625—样品的稀释倍数;
WS—标准溶液中核黄素浓度的数值,单位为毫克每毫升(mg/mL);
PS—标准溶液色谱图中核黄素的峰响应值;
PD—样品溶液色谱图中三种核黄素二磷酸盐峰的总响应值。
实验结果以平行测定结果的算术平均值为准。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值与算术平均值的比值不大于1.5%。
相关链接:添加剂核黄素5'-磷酸钠检验方法(二)
文章来源:《食品安全国家标准汇编食品添加剂(二)》
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