5.3.1.4 细胞毒性测定

将上述首次消化计数后的细胞每皿接种200个,每组5个皿,37℃、5%二氧化碳条件下培养7d,固定,Giemsa染色,计数每皿集落数。

5.3.1.5 突变体的选择及集落形成率的测定

表达结束后，消化细胞,分种，每组5个皿,每皿接种200个细胞,不加6-TG,7d后固定,Giemsa染色,统计每皿集落数,计算集落形成率。同时另做突变頻率测定,每组5个皿,每皿接种2×10⁵个细胞，待细胞贴壁后加入6-TG(建议使用终浓度为5ug/mL～10ug/mL),放入培养箱培养8d～10d后固定,Giemsa染色,统计每皿集落数,并计算突变頻率。

5.3.2 悬浮生长细胞的试验步骤和观察指标

5.3.2.1 细胞准备及接受试物

取生长良好的细胞,调整密度为5×10⁵/mL,按1%体积加入一定浓度的受试物及S9混合物(无需代谢活化者用无血清培养液补足)，37℃振摇处理3h～6h,以800r/min～1000r/min的速度离心4min～6min,弃上清液,用PBS或无血清培养液洗细胞2次,重新悬浮细胞于含10%马血清的RPMI 1640培养液中，并调整细胞密度为2×10⁵/mL。

5.3.2.2 PE0(0天的平板接种效率)测定

取适量细胞悬液,作梯度稀释至8个细胞/mL,接种96孔板(每孔加0.2mL,即平均1.6个细胞/孔)，每个剂量接种1～2块平板,37℃,5%二氧化碳,饱和湿度条件下培养9d～11d,计数每块平板有集落生长的孔数。

5.3.2.3 表达

取5.3.2.1所得细胞悬液,作6d表达培养,每天计数细胞密度并保持密度在1×100/mL以下。

5.3.2.4 PEs(第六天的平板接种效率)测定

表达培养结束后,取适量细胞悬液,按“5.322”方法测定PE6。

5.3.2.5 突变频率(MF)测定

表达培养结束后,取适量细胞悬液，调整细胞密度为1×10⁵/mL,加入6-TG(建议使用终浓度为5ug/mL～15ug/mL),混匀，接种96孔板(每孔加0.2mL,即2×10⁴个细胞/孔)，每个剂量接种2～4块平板,37℃,5%二氧化碳,饱和湿度条件下培养11d～14d,计数有突变集落生长的孔数。

6 数据处理和结果评价

6.1 数据处理

6.1.1 贴壁生长细胞HGPRT试验数据处理

6.1.1.1 细胞毒性

以相对于溶媒对照组的集落形成率表示细胞毒性。即以溶媒对照的集落形成率为100%(1.00),求出各受试物组的相对值。

相对集落形成率的计算见式(1):

A=B/CX100%---------------(1)

式中：

A—相对集落形成率，％；

B—受试物组集落形成率,％；

C—溶媒对照组集落形成率，％。

6.1.1.2 集落形成率和突变频率

集落形成率的计算见式(2)：

D=E/F×100%-------------(2)

式中：

D—集落形成率,％；

E—实际存活的细胞集落数；

F—接种细胞数。

突变频率的计算见式(3)：

式中：

G—突变频率；

H—突变集落数；

I—接种细胞数；

D—集落形成率。

文章来源：《食品安全国家标准汇编检验方法（二）》

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