北京普天同创生物科技有限公司
5 试验方法
5.1 受试物
5.1.1 受试物的配制
固体受试物应溶解或悬浮于适合的溶媒中,并稀释至适当浓度。液体受试物可直接使用或稀释至适当浓度。受试物应在使用前现用现配,否则就必须证实贮存不影响其稳定性。
5.1.2 溶媒的选择
溶媒必须是非致突变物,不与受试物发生化学反应,不影响细胞存活和S9活性。首选溶媒是蒸馏水;对于不溶于水的受试物可选择其他溶媒,首选二甲基亚砜(DMSO),但使用时浓度不应大于0.5%。
5.1.3 对照
每一项试验中,在代谢活化系统存在和不存在的条件下均应设阳性和阴性(溶媒)对照组。
5.1.3.1 阳性对照
当使用代谢活化系统时,阳性对照物必须是要求代谢活化、并能引起突变的物质,可以使用3-甲基胆蒽(3-methylcholanthrene)、N-亚硝基二甲胺(N-nitroso-dimethylamine)、7,12-二甲基苯并[a]蒽(7,12-dimethylbenz[α]anthracene)等。在没有代谢活化系统时,阳性对照物可使用甲磺酸乙酯(ethylmethanesulphonate)、乙基亚硝基脲(ethylnitrosourea)等。也可使用其他适宜的阳性对照物。
5.1.3.2 阴性对照
阴性对照(包括溶媒对照)除不含受试物外,其他处理应与受试物相同。此外,当不具有实验室历史资料证实所用溶媒无致突变作用和无其他有害作用时,还应设空白对照。
5.2 剂量
5.2.1 最高浓度选择
决定最高浓度的因素是细胞毒性、受试物在试验系统中的溶解度以及PH或渗透压的改变。
5.2.2 细胞毒性确定
应使用指示细胞完整性和生长情况的指标,在代谢活化系统存在和不存在两种条件下确定细胞毒性,例如相对集落形成率或相对存活率。应在预试验中确定细胞毒性和溶解度。
5.2.3 浓度设置和量离浓度选择
至少应设置4个可供分析的浓度。当有细胞毒性时,其浓度范围应包括从最大毒性至几乎无毒性,通常浓度间隔系数在2~之间;如量高浓度是基于细胞毒性,那么该浓度组的细胞相对集落形成率或相对存活率应为10%~20%(不低于10%).对于那些细胞毒性很低的化合物,最高浓度应是5μL/mL、5mg/mL或0.01mol/L。对于相对不溶解的物质,其最高浓度应达到或超过在细胞培养状态下的溶解度限值;最好在试验处理开始和结束时均评价溶解度,因为由于S9等的存在,试验系统内在暴露过程中溶解度可能发生变化;不溶解性可用肉眼鉴别,但沉淀不应形晌观察。
5.3 试验步骤和观察指标
5.3.1 贴壁生长细胞的试验步骤和观察指标
5.3.1.1 细胞准备
将5×105个细胞接种于直径为100mm平皿中,于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养24h。
5.3.1.2 接触受试物
吸去培养液,PBS洗两次,加入一定量的无血清培养液、一定浓度的受试物及S9混合物(无需代谢活化者用无血清培养液补足),置于培养箱中3h~6h,结束后吸去含受试物的培养液,用PBS洗细胞两次,换入含10%血清的培养液,继续培养19h~22h。
5.3.1.3 表达
接触受试物的细胞继续培养19h~22h后用胰酶-EDTA消化,待细胞脱落后,加入含10%血清的培养液终止消化,混匀,放入离心管以800r/min~1000r/min的速度离心5min~7min,弃上清液,制成细胞悬液,计数,以5×105个细胞接种于直径为100mm的平皿,3d后传代,仍接种5×105个细胞培养3d(最佳表达时间为6d~8d)。
文章来源:《食品安全国家标准汇编检验方法(二)》
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