北京普天同创生物科技有限公司
1 范围
本标准规定了体外哺乳类细胞次黄嘌吟鸟嘌吟磷酸核糖转移酶(HGPRT)基因突变试验的基本试验方法和技术要求。
本标准适用于评价受试物的致突变作用。
2 术语和定义
2.1 HGPRT基因
哺乳类动物的次黄嘌吟鸟嘌吟磷酸核糖转移酶基因。在人类,HGPRT基因定位于X染色体的长臂,坐标为Xq26.1;在小鼠也定位于X染色体。
2.2 突变频率
在某种细胞系中,某一特定基因突变型的细胞(集落)占细胞(集落)总数的百分率。
3 试验目的和原理
细胞在正常培养条件下,能够产生HGPRT,在含有6-硫代鸟嘌吟(6-thioguanine,6-TG)的选择性培养液中,HGPRT催化产生核苷-5'-单磷酸(NMP),NMP掺入DNA中致细胞死亡。在致癌和(或)致突变物作用下,某些细胞X染色体上控制HGPRT的结构基因发生突变,不能再产生HGPRT,从而使突变细胞对6-TG具有抗性作用,能够在含有6-TG的选择性培养液中存活生长。
在加入和不加入代谢活化系统的条件下,使细胞暴露于受试物一定时间,然后将细胞再传代培养,在含有6-TG的选择性培养液中,突变细胞可以继续分裂并形成集落。基于突变集落数,计算突变频率以评价受试物的致突变性。
4 材料和试剂
4.1 细胞
常用中国仓鼠肺细胞株(V79)和中国仓鼠卵巢细胞株(CHO),其他如小鼠淋巴瘤细胞株(L5178Y)和人类淋巴母细胞株(TK6)亦可。细胞在使用前应进行有无支原体污染的检查。
4.2 培养液
应根据试验所用系统和细胞类型来选择适宜的培养基。对于V79和CHO细胞,常用最低必需培养基(MEM,Eagle)、改良EagIe培养基(DMEM)加入10%胎牛血清和适量抗菌素。对于TK6和L5178Y细胞,常用RPMI1640培养液,加入10%马血清(培养瓶培养)或20%马血清(96孔板培养)和适量抗菌素(青霉素、链霉素)。
4.3 胰蛋白酶/EDTA溶液
用无钙、镁PBS配制,胰酶的浓度为0.05%,EDTA的浓度为0.02%,胰蛋白酶与EDTA溶液按1:1混合。-20℃储存。
4.4 活化系统
通常使用的是S9混合物。S9的制备方法如下:
选健康雄性成年SD或Wistar大鼠,体重150g~200g,周龄约5周~6周。将多氯联苯(Aroclor1254)溶于玉米油中,浓度为200g/L,按500mg/kg体重无菌操作一次腹腔注射,5d后处死动物,处死前禁食12h。
也可采用苯巴比妥钠和β-萘黄酮联合诱导的方法进行制备,经口灌胃给予大鼠苯巴比妥钠和β-萘黄酮,剂量均为80mg/kg,连续3d,禁食16h后断头处死动物。其他操作同多氯联苯诱导。
处死动物后取出肝脏,称重后用新鲜冰冷的氯化钾溶液(0.15mol/L)连续冲洗肝脏数次,以便除去能抑制微粒体酶活性的血红蛋白。每克肝(湿重)加氯化钾溶液(0.1mol/L)3mL,连同烧杯移入冰浴中,用无菌剪刀剪碎肝脏,在玻璃匀浆器(低于4000r/min,1min~2min)或组织匀浆器(低于20000r/min,1min)中制成肝匀浆。以上操作需注意无菌和局部冷环境。
将制成的肝匀浆在低温(0℃~4℃)高速离心机上以9000g离心10min,吸出上清液为S9组分,分装于无菌冷冻管或安瓿中,每安瓿2mL左右,用液氮或干冰速冻后置-80℃低温保存。
S9组分制成后,经无菌检查,测定蛋白含量(Lowry法),每毫升蛋白含量不超过40mg为宜,并经间接致癌物(诱变剂)鉴定其生物活性合格后贮存于深低温或冰冻干燥,保存期不超过1年。
S9的使用浓度为1%~10%(终浓度)。
4.5 选择剂
6-硫代鸟嘌吟(6-TG),建议使用终浓度为5ug/mL~15ug/mL,用碳酸氢钠溶液(0.5%)配制。
4.6 预处理培养液(THMG/THG)
为减少细胞的自发突变频率,在试验前,先将细胞加在含THMG的培养液中培养24h,杀灭自发的突变细胞,然后再将细胞接种于THG(不含氨甲喋吟的THMG培养液)中培养1d~3d至细胞恢复正常生长周期和形态。
THMG所含各物质终浓度如下(除培养液成分外):
—胸苷,5×10-6 mol/L;
—次黄嘌吟,5×10-5 mol/L;
—氨甲喋吟,4×10-7 mol/L;
—甘氨酸,1×10-4 mol/L。
文章来源:《食品安全国家标准汇编检验方法(二)》
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