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体外哺乳类细胞DNA损伤修复(非程序性DNA合成)试验(三)

发布时间:2020-05-26 00:00 作者:中国标准物质网 阅读量:1193

5.6 操作步骤

注:根据实验室情况,可选择通过DNA放射自显影显示法或液体闪烁技术显色法(LSC)的方法测定染毒细胞中3H-TdR的掺入量。

5.6.1 UDS的放射自显影显示法

将细胞增殖至所需数量后,按上述方法制成单细胞悬液。浓度为0.5×105个/mL~1×105个/mL。将上述细胞悬液接种于置有小盖片(18mm×6mm)之培养瓶中,37℃培养1d~3d,使细胞在盖片上生长至适当密度。培养瓶接种数目根据受试物的数目、所选剂量级别而定。每一剂量作2个~3个样片,并另备4个~6个样本供溶媒对照和已知致癌物的阳性对照用。细胞在增殖培养后,用同步培养基(ADM补以1%小牛血清)作同步培养3d~4d。在试验前一日下午,加入溶于ADM之羟基脲(HU)溶液,使HU在培养基中之终浓度为10mmol/L。继续在37℃下孵育16h,然后将上述长有细胞之盖片置于含有不同浓度之受试物、HU[c(HU)=10mmol/L]及3H-胸腺嘧啶核苷(5uCi/mL~10μCi/mL,30Ci/mmol)之同步用培养基中。37℃中孵育5h。

孵育结束后,用HBSS充分洗涤,用1%柠檬酸钠溶液处理10min,随后用乙醇(64-17-5)-冰乙酸(3:1)固定(4℃)过夜,空气中干燥后,用少量中性树胶,将盖片粘固于载玻片上,长有细胞的一面朝上,45℃烘烤24h。

在暗室中,将适量之核-4乳胶移入浸渍用之玻璃器皿中,于40℃水浴中融化,同时取等量之蒸馏水于一量筒中也置于该水浴中加热,待乳胶融化后,将热蒸馏水倾于乳胶液中,继续在水浴中加温,并用玻璃棒轻轻搅拌,等待10min~20min,使气泡逸出。将准备作自显影处理之玻片置于水浴之平台上预热。将玻片垂直浸渍于1:1稀释之乳胶液中约5s,徐徐提岀玻片,并将玻片背面之乳胶用纱布或擦镜纸拭去,将已涂有乳胶之玻片移入温度为29℃及一定湿度之温箱中(4h)待乳胶干涸。然后置于内置适量干燥剂(变色硅胶)袋之曝光盒中。曝光盒外包以黑色避光纸及塑料纸,置于4℃冰箱中曝光10d。曝光结束后,将玻片移入有机玻璃制成的玻片架上,在液温为19℃之D-170或D-196显色液中显影5min,在停显液中漂洗2min,在F-5定影液中定影6min~10min,再用水漂洗数小时。

细胞可在乳胶涂片前用地衣红(2%)冰乙酸溶液或在显影液后用H.E或Giemsa染液染色。将玻片脱水透明后,用盖片封固。

在油渍镜下,计数各样本细胞核的显影银粒数,同时计数相同面积之本底银粒数,并计算出两者的差值。每张玻片至少计数50个细胞核,计算出对照组、各受试物组及阳性对照组的银粒数的均值和标准差等统计量。

为了区分UDS和正常的DNA半保留复制,可采用精氨酸缺乏的培养基、低血清培养基或在培养基中添加羟基脲的方法来减少和抑制正常的DNA半保留复制。

5.6.2 UDS的液体闪烁技术显色法

将试验用细胞悬于生长用培养基中,细胞浓度为0.5×105个/mL,将细胞接种于液体闪烁计数瓶中,每瓶1mL,并加入14C胸腺嘧啶核苷终浓度为0.01uCi/mL(50mCi/mmol)。37℃中培养48h使细胞增殖并预标记,去培养基并用HBSS洗涤后,换以含14C-胸腺嘧啶核苷(0.01uCi/mL)之同步用培养基,在37℃中进行同步培养2d~4d,于试验前一天下午去培养基,用HBSS充分洗涤后,加入含有羟基脲[c(HU)=10mmol/L]之同步用培养基,37℃中孵育16h,UDS的诱发同放射显影显示法,细胞在含有HU及3H-胸腺嘧啶核苷(5uCi/mL,30Ci/mmol)之同步用培养基中与不同浓度之受试物接触5b,孵育结束后,去培养基及受试物。以冷盐水洗涤2次,随后用冰冷的过氯酸[7601-90-3,C(HClO4)=0.25mol/L]溶液处理2次,每次2min,再用乙醇处理10min,干后以0.5mL过氯酸[c(HCIO4)=0.5mol/L~1mol/L]于75℃~80℃之恒温箱中水解40min。冷却后加入乙二醇乙醚3.5mL及闪烁液(PPO 0.5%、POPOP 0.03%,以甲苯为溶媒)5mL,振荡均匀,以液体闪烁计数器测定各样本中之14C及3H的放射活性。每组(包括对照组)至少做6个培养瓶。

标本中的3H放射活性即反映UDS中3H-胸腺嘧啶核苷的掺入量;而14C的放射活性反映试验细胞的数目或其DNA量,因此F和14C放射活性之比(3H/14C)即为细胞单位数或单位质量DNA中UDS水平。若将阴性对照组的3H/14C作为100%(1.00),计算出各受试物组与阴性对照组的变化量及受试物组各测试浓度的均值和标准差等统计量。

6 数据处理和结果评价

6.1 数据处理

选用合适的统计方法如“t检验”,判断各受试物组与溶媒对照组间差异有无统计学意义,对数据进行分析和评价。

6.2 结果评价

受试物组的细胞3H-TdR掺入数随剂量增加而增加,且与阴性对照组相比有统计学意义,或者至少在一个测试点得到可重复并有统计学意义的掺入量增加,均可判定为该试验阳性。

7 试验报告

7.1 试验名称、试验单位名称和联系方式、报告编号。

7.2 试验委托单位名称和联系方式、样品受理日期。

7.3 试验开始和结束日期、试验项目负责人、试验单位技术负责人、签发日期。

7.4 试验摘要。

7.5 受试物:名称、细胞株、CAS编号(如已知)、纯度、与本试验有关的受试物的物理和化学性质及稳定性等。

7.6 溶媒:溶媒的选择依据,受试物在溶媒中的溶解性和稳定性。

7.7 细胞株:名称、来源、浓度及培养条件(包括培养基的组成、培养温度、CO2浓度和培养时间)。

7.8 试验条件:剂量、代谢活化系统、细胞株、标准诱变剂、操作步骤等。

7.9 试验结果:受试物对细胞株的毒性、是否具有剂量-反应关系、统计结果,同时进行的溶媒对照和阳性对照的均数和标准差。

7.10 结论:本试验条件下受试物是否具有致突变作用。

8 试验的解释

受试物组的细胞3H-TdR掺入数不随剂量增加而增加,各剂量组与对照组比较均无统计学意义,则认为受试物在该试验系统下不引起UDSO判定结果时,应综合考虑生物学意义和统计学意义。

相关链接:体外哺乳类细胞DNA损伤修复(非程序性DNA合成)试验(二)

 

 

文章来源:《食品安全国家标准汇编检验方法(二)》

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