5 操作步骤

5.1 增菌

以无菌操作取样品25g(mL)加入到含有225mL LB₁增菌液的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质1min～2min；或放入盛有225mL LB₁增菌液的均质杯中，8000r/min～10000r/min均质1min～2min。于30℃±1℃培养24h,移取0.1mL,转种于10mL LB₂增菌液内，于30℃±1℃培养18h～24h。

5.2 分离

取LB₂二次增菌液划线接种于PALCAM琼脂平板和李斯特氏菌显色培养基上，于36℃±1℃培养24h～48h,观察各个平板上生长的菌落。典型菌落在EALCAM琼脂平板上为小的圆形灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷；典型菌落在李斯特氏菌显色培养基上的特征按照产品说明进行判定。

5.3 初筛

自选择性琼脂平板上分别挑取5个以上典型或可疑菌落，分别接种在木糖、鼠李糖发酵管，于36℃±1℃培养24h；同时在TSA-YE平板上划线纯化，于30℃±1℃培养24h～48h。选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定。

5.4 鉴定

5.4.1 染色镜检：李斯特氏菌为革兰氏阳性短杆菌，大小为(0.4um～0.5um)×(0.5um～2.0um);用生理盐水制成菌悬液，在油镜或相差显微镜下观察，该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。

5.4.2 动力试验：李斯特氏菌有动力，呈伞状生长或月牙状生长。

5.4.3 生化鉴定：挑取纯培养的单个可疑菌落，进行过氧化氢酶试验，过氧化氢酶阳性反应的菌落继续进行糖发酵试验和MR-VP试验。单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特征见表1。

5.4.4 溶血试验：将羊血琼脂平板底面划分为20个～25个小格，挑取纯培养的单个可疑菌落刺种到血平板上，每格刺种一个菌落，并刺种阳性对照菌(单增李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌)和阴性对照菌(英诺克李斯特氏菌)，穿刺时尽量接近底部，但不要触到底面，同时避免琼脂破裂，36℃±1℃培养24h～48h,于明亮处观察，单增李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生狭小的透明溶血环，英诺克李斯特氏菌无溶血环，伊氏李斯特氏菌产生大的透明溶血环。

5.4.5 协同溶血试验(CAMP)：在羊血琼脂平板上平行划线接种金黄色葡萄球菌和马红球菌，挑取纯培养的单个可疑菌落垂直划线接种于平行线之间，垂直线两端不要触及平行线，于30℃±1℃培养24h～48h。单核细胞增生李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌的接种端溶血增强,斯氏李斯特氏菌的溶血也增强，而伊氏李斯特氏菌在靠近马红球菌的接种端溶血增强。

5.5 可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统等对5.3中3个～5个纯培养的可疑菌落进行鉴定。

表1单核细胞增生李斯特氏菌生化特征与其他李斯特氏菌的区别

5.6 小鼠毒力试验(可选择)

将符合上述特性的纯培养物接种于TSB-YE中，于30℃±1℃培养24h,4000r/min离心5min,弃上清液，用无菌生理盐水制备成浓度为10¹⁰ CFU/mL的菌悬液，取此菌悬液进行小鼠腹腔注射3只～5只，每只0.5mL,观察小鼠死亡情况。致病株于2d～5d内死亡。试验时可用已知菌作对照。单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌对小鼠有致病性。

6 结果与报告

综合以上生化试验和溶血试验结果，报告25g(mL)样品中检出或未检出单核细胞增生李斯特氏菌。

相关链接：食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验（二）

文章来源：《食品安全国家标准汇编检验方法（二）》

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