3.4 测定步骤

3.4.1 样液制备

称取10.0g试样(精确至0.1g)于均质杯内，加入10 mL缓冲液Ⅱ，搅匀，放置60 min，均质2 min(10000r/min)后，放入水浴锅中煮沸3 min。移入离心管中离心不少于10 min(4000r/min以上)，取出上清液。在残渣中再加10 mL缓冲液且，按上述方法均质、离心，取出上清液。合并两次上清液，并定容为20 mL作为样液。

3.4.2 菌悬液的制备

将支气管败血性博代氏杆菌接种于培养基工制成的试管斜面上于(36±1)℃培养16～24 h后，再转种到培养基H中，于(36±1)℃培养16～24 h，制成菌悬液(使用时注意摇匀)。

3.4.3 菌悬液最佳用量测定

测试前应先用0.025ug/mL 粘菌素标准工作液，对上述菌悬素液进行预测试。以不同量的菌悬液加入经熔化并冷却至45～50℃的培养基Ⅲ中，充分混合，并经(36±1)℃培养(17±1)h后，选择能使该标准工作液产生直径大于等干10 mm清晰完整的抑菌圈的菌悬液加入量，即为菌悬液的最佳用量。

3.4.4 检定平板制备

将培养基Ⅲ熔化，注20 mL于灭菌培养皿内保持水平，待其凝固，作为基层。另取培养基Ⅲ熔化，冷却至45～50℃，加入上述测得的最佳菌悬液用量，充分混合，取约4 mL注入已铺有基层培养基的平板中作种层，保持水平，使其凝固，制成检定用的平板。所用平板需当天制备。

3.4.5 标准曲线的绘制

用粘菌素标准工作液(3.2.6)绘制标准曲线。以0.05 ug/mL 浓度的标准工作液为参考浓度；以0.0125ug/mL浓度的标准工作液作阴性对照用。每个标准工作液浓度取三个检定平板作为一组，每个平板上置4个牛津杯，使牛津杯在半径为2.5cm的圆面成90^o角间距，对角两个杯中注满0.05ug/mL参考浓度标准工作液，另两个对角杯中注满其他浓度的一种标准工作液。4个浓度标准工作液共12个检定平板，用于制备标准曲线。其中0.05ug mL参考浓度的标准工作液将得到24个抑菌圈直径的数值，而其他标准工作液分别得到6个抑菌圈直径的数值。

盖好平皿盖，置(36±1)℃培养(17±1)h。翻转平板，除去牛津杯，测量各个浓度产生的抑菌圈直径(精确到0.1mm)，求得各自的平均值。再求出0.05 ug/mL参考浓度24个抑菌圈直径的平均值。用参考浓度的抑菌圈直径的总平均值减去每组平板参考浓度的抑菌圈直径平均值的差，即为各组平板的校正值。将校正后的值用式(1)和式(2)算出L和H点的直径值，在半对数坐标纸上，以抑菌圈直径为横坐标(算术级)，粘菌素浓度为纵坐标(对数级)。通过L和H点连一直线即为标准曲线。

式中：L—标准曲线上最低浓度抑菌圈的直径，mm；

H—标准曲线上最高浓度抑菌圈的直径，mm；

b—参考浓度0.05 ug/mL的24个抑菌圈直径的平均值，mm；

a,c,d—分别表示标准曲线上其他标准工作液浓度(0.025,0.1,0.2ug/mL)的抑菌圈直径经校正后的平均值，mm。

3.4.6 样液的测定

每份样液取3个检定平板。在每个平板上置4个已灭菌的牛津杯(按制备标准曲线方法放置)，在对角的2只牛津杯里注满被检样液，在剩余的2只牛津杯里分别注满粘菌素参考浓度标准工作液(即0.05 ug/mL)。于(36±1)℃培养(17±1)h，翻转平板．除去牛津杯。如有抑菌圈产生，量取抑菌圈直径(精确到0.1mm)。

3.5 结果的计算和表述

如样液抑菌圈的直径小于10 mm，即报告为“阴性”。

如样液抑菌圈的直径大于等于10 mm，求出每组三个检定平板上样液和参考浓度标准工作液抑菌圈直径的平均值，经校正后，从标准曲线上查出相应的粘菌素的浓度，通过式(3)，计算试样中粘菌素残留的含量：

式中：X—试样中粘菌素残留的含量，mg/kg;

c—从标准曲线上查得样液中粘菌素浓度，ug/mL；

m—每毫升最终样液所代表的试样量，g。

注：如测定结果呈阳性，即所显的抑菌圈直径的平均值大于等于10 mm，必要时尚需进行确证试验，以证明抑菌物确系粘菌素。

4 测定低限和回收率

4.1 测定低限

本方法的测定低限为0.05 mg/kg。

4.2 回收率

鸭肉中粘菌素添加浓度及其回收率的实验数据：

0.050 mg/kg时，回收率为78.0％;

0.100 mg/kg时，回收率为85.0％;

0.200 mg/kg时，回收率为90.0％。

文章来源：《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》

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