8.5 实时荧光PCR检测

8.5.1 实时荧光PCR反应体系

实时荧光PCR反应体系见表2。每个样品进行实时荧光PCR检测时应设置2个平行。实时荧光PCR检测过程中应设置PCR扩增试剂对照、PCR扩增阴性目标DNA对照、PCR扩增阳性目标DNA对照，并对DNA提取和纯化过程中设置的核酸提取空白对照同时进行实时荧光PCR检测，具体方式按照GB/T 19495.2中相关规定。

表2 实时荧光PCR反应体系

8.5.2 实时荧光PCR反应参数

实时荧光PCR反应参数见表3。使用不同实时荧光PCR仪，可对参数作适当调整。

表3 实时荧光PCR反应参数3

8.5.3 仪器检测通道的选择

设置PCR反应管荧光信号收集条件，应与探针标记的报告基团一致。具体设置方法可参照仪器使用说明书。

9 结果分析、判断和表述

9.1 基线和阈值的设置

实时荧光PCR反应结束并分析结果时，应设置基线和闽值。基线范围设置在3个～15个循环。基线阈值设置在基线刚好超过正常阴性目标DNA对照扩增曲线最高点且Ct=40，通常情况下可以采用仪器默认的基线阈值，即采用3个～15个循环的阴性日标DNA对照的10倍标准差作为阈值。

9.2 质量控制

9.2.1 基本原则

实验中设置的各种对照PCR检测结果应符合以下情况：否则，任一种对照如果出现非9.2.2～9.2.4所述正常结果，应重做实验。

9.2.2 核酸提取空白对照和PCR扩增试剂对照空白对照

外源基因检测结果Ct≥40，内源基因检测结果Ct≥40。

9.2.3 PCR扩增阴性目标DNA对照

外源基因检测结果Ct≥40，内源基因检测结果20≤Ct≤36。

9.2.4 PCR扩增阳性目标DNA对照

外源基因检测结果Ct≤36。

9.3 结果判断和表述

9.3.1 待测样品外源基因2个平行样检测结果Ct≥40，内源基因检测20≤Ct≤36并出现典型的扩增曲线，同时各种实验对照结果正常，此时可以判定该样品未检出XXX基因，检测结果表述为未检出XXX基因。

9.3.2 待测样品外源基因至少1个平行样检测结果36＜Ct＜40并出现典型的扩增曲线，内源基因检测20≤Ct≤36并出现典型的扩增曲线，同时各种实验对照结果正常，此时应适当增加DNA模板量后重做实时荧光PCR检测。再次检测结果外源基因仍然C<40并出现典型的扩增曲线，同时各种实验对照结果正常，可以判定该样品检出XXX基因；再次检测结果外源基因Ct≥40，同时各种实验对照结果正常，可以判定该样品未检出XXX基因，检测结果表述为未检出XXX基因。

9.3.3待测样品外源基因2个平行样检测结果Ct≤36并出现典型的扩增曲线，内源基因检测20≤Ct≤36并出现典型的扩增曲线，同时各种实验对照结果正常，此时可以判定该样品检出XXX基因，检测结果表述为检出XXX基因。

10 检测低限

本方法未确定绝对检测低限和相对检测低限，但实验证明本方法能检测出含量为0.01％的转基因玉米和大豆成分。

相关链接：调味品中转基因植物成分实时荧光PCR定性检测方法（二）

文章来源：《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》

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