5 试样制备与保存

5.1 试样制备

从原始样品中取出部分有代表性样品，将可食部分用绞碎机绞碎，充分混匀，用四分法缩分出不少于500 g作为试样。装入清洁容器中，加封后，标明标记。

5.2 试样保存

将试样于-20℃冷冻保存。

6 测定方法

6.1 原理

对样品进行DNA提取，使之适用于PCR检测技术，通过实时荧光PCR，检测其中是否含有牛特异性基因序列，达到对食品中牛成分定性PCR检测的目的。

6.2 主要仪器

6.2.1 实时荧光PCR仪。

6.2.2 恒温水浴锅。

6.2.3 离心机：离心力不小于12000g。

6.2.4 微量移液器：0.5uL～10uL，10uL～100uL，20uL～200uL，200uL～1000 uL。

6.2.5 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。

6.2.6 pH计。

6.2.7 天平：感量0.01g。

6.3 主要试剂

除另有规定外，所有实验使用的试剂等级应为不含DNA和DNase的分析纯或生化试剂。条件许可的情况下推荐使用优级纯试剂。试剂的选购、验收、储存应符合GB/T 15481的规定。

6.3.1 实验用水：应符合GB/ T 6682中一级水的规格。

6.3.2 琼脂糖。

6.3.3 CTAB提取缓冲液：CTAB 20g/L，氯化钠1.4 mol/L，Tris 0.1mol/L，Na₂EDTA 20 mmol/L, pH 8.0，高压灭菌。使用前加入终浓度为2％的β-巯基乙醇。

6.3.4 CTAB沉淀液：CTAB 5g/L，氯化钠0.04 mol/L，pH 8.0，高压灭菌。

6.3.5 氯化钠溶液：1.2 mol/L。

6.3.6 蛋白酶K溶液：冻干品，用高压灭菌的去离子水或双蒸水溶解为20 mg/mL的溶液，分装后于-20℃保存，避免反复冻融。

6.3.7 无水乙醇、异丙醇等有机试剂。

6.3.8 食物基因组DNA提取纯化试剂盒。

6.3.9 10×PCR缓冲液：氯化钾100 mmol/L，硫酸铵160 mmol/L，硫酸镁20 mmol/L, Tris-HCI(pH 8.8)200 mmol/L，Triton X-100 1％，BSA 1 mg/mL。

6.3.10 氯化镁溶液：2.5 mmol/L。

6.3.11 dNTP溶液(dGTP、dCTP、dATP、dTTP或dUTP)：各2.5 mmol/L。

6.3.12 Taq酶。

6.3.13 UNG酶(以dUTP代替dTTP时)。

6.3.14 引物和探针：食品中牛成分PCR检测所用引物序列和探针序列见表1。

表1 检测用引物和探针

文章来源：《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》

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