5.4.4CTAB法制备油脂类饲料模板DNA

取油脂饲料适量(液态油取30 mL,磷脂类和固态油脂取5g)放入250 mL三角瓶中，加入25 mL正己烷，于磁力搅拌器上不断振荡混合2h后，加入25mL，CTAB提取缓冲液Ⅱ，继续于磁力搅拌器上振荡混合2h；将溶液转入100 mL离心管中，于8000r/min离心10 min，使有机相和水相分离，取下层水相，加入与下层水相溶液等体积的异丙醇及水相溶液1/10体积的3 mol/L乙酸钠溶液，轻缓颠倒混匀，室温放置10 min; 12000r/min离心10 min,弃上清液，待沉淀干燥后用200uL TE缓冲液溶解沉淀，加入200 uL Tris饱和苯酚＋三氯甲烷，轻缓颠倒混匀溶液；12000r/min离心10 min，取上清液，加入与上清液等体积三氯甲烷＋异戊醇，轻缓颠倒混匀，12000r/min离心2 min至分层；将上清液转移至干净的离心管中，加入与溶液等体积的异丙醇及溶液1/10体积的3 mol/L乙酸钠溶液，轻缓颠倒混匀；室温放置10 min后，12000r/min离心10 min，弃上清液后，依次加入800uL体积分数为75％的乙醇和100 uL体积分数为75％的乙醇洗涤沉淀；12000r/min离心5 min，弃除乙醇溶液；待沉淀干燥后，DNA沉淀溶解于100uL TE缓冲液中，待测或于-20℃保存备用。

5.4.5试剂盒法

采用商品化的动物源性植物饲料基因组DNA提取试剂盒，按照试剂盒使用说明提取DNA。

5.4.6 核酸浓度测定落

提取的DNA只适合采用紫外分光光度法进行定量，所测得OD值为核酸总量。紫外分光光度法检测核酸浓度的最佳范围是2 ug/mL～50 ug/mL,OD值应该在0.05～1.00的区间内。将DNA溶液作适当的稀释，放入紫外分光光度计的比色皿中，于260 nm和280 nm处测定其吸收峰，1OD_260nm=50 ug/mL 双链DNA或38 ug/mL单链DNA。用于PCR反应的DNA溶液的OD _{260 nm}/OD_{280 nm}比值一般不低于1.4。

注：油脂类饲料模板提取后，可省略核酸定量，直接进行实时荧光PCR检测。

5.4.7 实时荧光PCR检测

5.4.7.1 实时荧光PCR反应体系

实时荧光PCR反应体系见表2。每个样品进行实时荧光PCR检测时应设置2个平行。

表2 实时荧光PCR反应体系

5.4.7.2 反应体系对照的设置

5.4.7.2.1 阳性对照

阳性对照为扩增片段的阳性克隆分子DNA或含禽源性成分(鸡、鸭、鹅、鹌鹑)饲料的DNA。

5.4.7.2.2 阴性对照

阴性对照为不含禽源性成分(鸡、鸭、鹅、鹌鹑)饲料的DNA。

5.4.7.2.3 空白对照

用配置反应体系的超纯水代替模板。

5.4.7.3 实时荧光PCR反应循环参数

实时荧光PCR反应循环参数见表3。使用不同实时荧光PCR仪，可对参数作适当调整。

表3 实时荧光PCR反应循环参数

5.5 结果及判断

5.5.1 质量控制

5.5.1.1 一般要求

实验中设置的各种对照PCR检测结果应符合以下情况。否则，任一种对照如果出现非下述正常结果，应重做实验。

5.5.1.2 核酸提取空白对照和PCR扩增试剂空白对照

检测结果Ct≥40.0。

5.5.1.3PCR扩增阴性目标DNA对照

检测结果Ct≥40.0。

5.5.1.4PCR扩增阳性目标DNA对照

检测结果Ct≥35.0。

5.5.2 结果判断和报告

5.5.2.1 样品2个平行样检测结果Ct≥40.0，同时各种实验对照结果正常，可以判断样品结果为阴性，报告未检出xxx源性成分。

5.5.2.2 样品至少1个平行样检测结果35.0＜Ct＜40.0并出现典型的扩增曲线，同时各种实验对照结果正常，此时应适当增加DNA模板量后重做实时荧光PCR检测。再次检测结果仍然Ct<40.0并出现典型的扩增曲线，同时各种实验对照结果正常，可以判断样品检出x x x源性成分，报告检出xxx源性成分；再次检测结果Ct＞40.0，同时各种实验对照结果正常，可以判断样品未检出xxx源性成分，报告未检出xxx源性成分。

5.5.2.3 样品2个平行样检测结果Ct≤35.0并出现典型的扩增曲线，同时各种实验对照结果正常，此时可以判断样品检出xxx源性成分，报告检出xxx源性成分。

相关链接：饲料中禽源性成分检测方法（二）

文章来源：《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》

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