PCR技术的强大扩增能力和很高的检测灵敏度，使极微量的污染即可导致假阳性结果，且在扩增过程中发生单核苷酸的错配，因而其最大的缺憾就在于灵敏度过高和非特异性扩增所带来的假阳性结果。实验中预防假阳性结果的产生，应考虑如下几方面情况。

(1)尽可能保证反应的忠实性 反应液中dNTP浓度明显低于Km值(μmol级以下)或某一dNTP的浓度低于其他3种时，会增加非特异掺入，且在正常情况下碱基掺入的错
配率也达1／400，由于Taq酶缺乏3’一5’端外切酶活性，故不能像Klenow片段那样对错进行修正，但错误掺入可使链延伸反应终止，从而限制缺陷分子的扩增。研究表明，Taq酶对A—T配对的延伸速度比G—T、C—T和T—T错配的速度快200倍、1400倍和2500倍，但dNTP浓度过高时会促进错配碱基的延伸。

为了保证反应的忠实性，应注意：4种dNTP要等物质的量且浓度合适，选择合适的循环数，勿使复性温度过低。

(2)减少结构相近的异源DNA在PCR操作过程中的污染，应采取预防及处理措施

①专门设置PCR室，配制反应缓冲液最好有超净工作台，模板制备、扩增体系的加液要相对隔离。

②所有试剂都要分装成小份，在一定的冰箱位置保存，使用从未接触过DNA的一次性器皿。

③操作时戴一次性手套。

④多份样品同时扩增时，最后加模板。

⑤设置阳性对照(用已知阳性模板)、阴性对照(不加模板DNA)，重要的实验结果进行重复试验。

⑥污染的器件可用稀盐酸擦拭或浸泡，可促使DNA脱嘌呤；对经常使用的超净台要常打开紫外灯照射30min，可促使DNA形成二聚体，阻止过度的延伸。

(3)其他因素

①热启动 Taq酶在低温下仍有活性，故当所有的反应成分混合后进入循环前，Taq酶可促进非特异延伸而导致非特异扩增。采用热启动(在温度达到70℃以上时再加酶或模板DNA)可克服这个问题。先将不含酶的反应混合物于94℃变性5～10min，立即置于冰浴中，再加酶进入循环，不但可保护酶活性，而且是热启动的一种方法。

②PCR促进剂 某些化学物质对比PCR反应的特异性有利，如10％二甲基亚砜(DMSO)，虽然DMSO对聚合酶活性有一定抑制作用，但它能影响引物的丁。值及变性
DNA的作用，可减少模板二级结构，提高PCR反应特异性。5％～20％的甘油可促进变性过程，尤对G+C含量高、二级结构多的靶序列和扩增片段长(1．5kb以上)时更适用；氯化四甲基铵(TMAC)[(O．1～1)×10^-4 mol／L]可减少非特异扩增而不抑制Taq酶。

③Taq酶抑制剂 不同浓度的变性剂(尿素、DMSO、DMF、甲酰胺等)对酶活性的影响不一样，许多离子型表面活性剂在极低浓度下(脱氧胆酸<0．06％，SDS<0．01％，N-月桂酰肌氨酸钠<O．02％)也可抑制Taq酶活性，而低浓度的NP一40和Tween -20可增强Taq酶活性。应用中，0．5％的NP-40／Tweell—20可迅速纠正SDS对Taq酶的抑制作用。