北京普天同创生物科技有限公司
7 测定步骤
7.1 提取
称取5g试样,精确至0.01g。将上述样品置于50 mL聚丙烯离心管(5.9)中,加入0.25 mL浓度为2.0mg/L的内标上作浴液(4.14),然后加入15 mL硫酸钠+亚硫酸钠提取溶液(4.6),均质1 min,在10℃以4000r/min离心5 min。将上清液转移到另一个干净的50 mL容量瓶中,残渣再分别加入15mL、10 mL硫酸钠+亚硫酸钠提取溶液提取两次,离心后,合并上清液,并用硫酸钠+亚硫酸钠提取溶液定容至50 mL,混合均匀,然后用玻璃滤纸过滤,待净化。
7.2 净化
取25 mL提取液(7.1)放入C18固相萃取柱(4.16)中,以约1 mL/min的流速使样液通过固相萃取柱,待样液全部通过后,依次用5 mL水和5 mL甲醇+水淋洗液(4.7)淋洗固相萃取柱,弃去全部流出液,减压抽干固相萃取柱10 min。最后用5 mL甲醇洗脱,洗脱液收集于15 mL玻璃离心管中,置于氮气浓缩仪(5.3)上在55℃吹至近干,用样品定容液(4.8)定容至1.0 mL。定容液混匀后,过0.45 um滤膜,供液相色谱测定。
7.3 测定
7.3.1 液相色谱条件
a)色谱柱:Inertsil ODS-3色谱柱,5 um,250 mm×4.6 mm或相当者;
b)柱温:30℃;
c)进样量:50uL;
d)流动相、流速及梯度洗脱条件见表1;
e)检测波长:265nm。
表1 梯度洗脱条件
7.3.2 液相色谱测定
将混合标准工作溶液分别进样,以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准工作曲线,用标准工作曲线对样品进行定量,样品溶液中4-甲酰氨基安替比林、4-甲基氨基安替比林和4-氨基安替比林的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下,4-甲酰氨基安替比林的参考保留时间为10.61 min, 4-氨基安替比林的参考保留时间为13.60 min, 4-甲基氨基安替比林的参考保留时间为14.76 min,内标化合物的参考保留时间为17.55 min。
4-甲酰氨基安替比林采用外标法定量;4-甲基氨基安替比林和4-氨基安替比林采用内标法进行定量。
7.4 平行试验
按以上步骤,对同一试样进行平行试验测定。
7.5 回收率试验
吸取适量混合标准工作溶液和内标标准工作溶液,用样品定容液(4.8)稀释成所需浓度的标准工作溶液。阴性样品中添加标准溶液,按7.2操作,测定后计算样品添加的回收率。
8 结果计算
4-甲酰氨基安替比林结果按式(1)计算:
式中:
X—试样中被测组分残留量,单位为微克每千克(mg/kg) ;
c—从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度,单位为纳克每毫升(ug/mL) ;
V—样品溶液最终定容体积,单位为毫升(mL) ;
m—样品溶液所代表最终试样的质量,单位为克(g)。
4-甲基氨基安替比林和4-氨基安替比林结果按式(2)计算:
式中:
X—试样中被测物残留量,单位为毫克每千克(mg/kg) ;
cs—基质标准工作溶液中被测物的浓度,单位为微克每毫升(ug/mL) ;
A—试样溶液中被测物的色谱峰面积;
As—基质标准工作溶液中被测物的色谱峰面积;
ci—试样溶液中内标物的浓度,单位为微克每毫升(ug/mL) ;
csi—基质标准工作溶液中内标物的浓度,单位为微克每毫升(ug/mL) ;
Asi—基质标准工作溶液中内标物的色谱峰面积;
Ai—试样溶液中内标物的色谱峰面积;
V一样液最终定容体积,单位为毫升(mL) ;
m—试样溶液所代表试样的质量,单位为克(g)。
注:计算结果应扣除空白值:
9 精密度
本部分的精密度数据是按照GB/T 6379.1和GB/T 6379.2的规定确定的,重复性和再现性的值以95%的可信度来计算。
9.1 重复性
在重复性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r,被测物的含量范围及重复性方程见表2。
如果差值超过重复性限,应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。
9.2 再现性
在再现性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R,被测物的含量范围及再现性方程见表2。
表2 含量范围及重复性和再现性方程
文章来源:《化学试剂标准汇编》
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