(二)液相色谱法

1．试验原理

用氢氧化钠溶液提取试样中的脱氢乙酸，经脱脂、去蛋白处理，过膜，用配紫外或二极管阵列检测器的高效液相色谱仪测定，以色谱峰的保留时间定性，外标法定量。

2．试剂和溶液

①甲醇(CH₄O)：色谱纯；正己烷(C₆H₁₄)。

②乙酸铵溶液(0.02mol/L )：称取1.54g乙酸铵，溶于水并稀释至1L。

③氢氧化钠溶液(20g/L)：称取20g氢氧化钠，溶于水并稀释至1L。

④甲酸溶液(10%)：量取10mL甲酸，加水90mL ,混匀。

⑤硫酸锌溶液(120g/L)：称取120g硫酸锌，溶于水并稀释至1L。

⑥甲醇溶液(70%)：量取70mL甲醇，加水30mL,混匀。

⑦脱氢乙酸标准储备液(1.0mg/mL)：准确称取脱氢乙酸标准品(纯度≥99.5%)0.1000g(精确至0.0001g)于100mL容量瓶中，用10mL氢氧化钠溶液溶解，用水定容。4℃保存，有效期为3个月。

⑧脱氢乙酸标准工作液：分别吸取脱氢乙酸标准贮备液0.1、1.0、5.0、10、20mL于100mL容量瓶中，用水定容，配制成浓度为1.00、10.0、50.0、100、200 ug/mL标准工作液。4℃保存，有效期为1个月。

3．仪器和设备

①高效液相色谱仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器。

②分析天平：感量为0.lmg和1mg。

③粉碎机、不锈钢高速均质器、涡旋混合器、pH计。

④超声波清洗器：功率35 kW。

⑤离心机：转速≥4000r/min。

⑥C₁₈固相萃取柱：500mg，6mL(使用前用5mL甲醇、10mL水活化，使柱子保持湿润状态)。

4．测定步骤

(1)样品处理

①果蔬汁、果蔬浆：称取样品2～5g(精确至0.001g)，置于50mL离心管中，加入约10 mL水，用氢氧化钠溶液调pH至7.5，转移至50mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。置于离心管中，4000r/min离心10min。取20mL上清液用10％的甲酸溶液调pH至5，定容到25 mL。取5 mL过已活化固相萃取柱，用5mL水淋洗，2mL 70％的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液2mL，涡旋混合，过0.45 um有机滤膜，供高效液相色谱测定。

②酱菜、发酵豆制品：样品用不锈钢高速均质器均质。称取样品2～5g(精确至0.001g)，置于25mL离心管中，加入约10mL水、5 mL硫酸锌溶液，用氢氧化钠溶液调pH至7.5，转移至25 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。置于25 mL离心管中，超声提取10min, 4000r/min离心10 min，取上清液过0.45 um有机滤膜，供高效液相色谱测定。

③面包、糕点、焙烤食品馅料、复合调味料：样品用粉碎机粉碎或不锈钢高速均质器均质。称取样品2～5g(精确至0.001g)，置于25 mL离心管(如需过固相萃取柱则用50mL离心管)中，加入约10mL水、5mL硫酸锌溶液，用氢氧化钠溶液调pH至7.5，转移至25 mL容量瓶(如需过固相萃取柱则用50mL容量瓶)中，加水稀释至刻度，摇匀。置于离心管中，超声提取10min，转移到分液漏斗中，加入10mL正己烷，振摇1min，静置分层，弃去正己烷层，加入10mL正己烷重复进行一次，取下层水相置于离心管中，4000r/min离心10min。取上清液过0.45um有机滤膜，供高效液相色谱测定。若高效液相色谱分离效果不理想，取20mL上清液，用10％的甲酸调pH至5，定容到25mL，取5mL过已活化的固相萃取柱，用5mL水淋洗，2 mL 70％的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液2mL，涡旋混合，过0.45 um有机滤膜，供高效液相色谱测定。

④黄油：称取样品2～5g(精确至0.001g)，置于25 mL离心管(如需过固相萃取柱则用50mL离心管)中，加入约10mL水、5mL硫酸锌溶液，用氢氧化钠溶液调pH至7.5，转移至25 mL容量瓶(如需过固相萃取柱则用50mL容量瓶)中，加水稀释至刻度，摇匀。置于离心管中，超声提取10min，转移到分液漏斗中，加入10mL正己烷，振摇1min，静置分层，弃去正己烷层，加入10mL正己烷重复进行一次，取下层水相置于离心管中，4000r/min离心10min。取上清液过0.45 um有机滤膜，供高效液相色谱测定。若高效液相色谱分离效果不理想，取20 mL上清液，用10％的甲酸调pH至5，定容到25mL，取5mL过已活化的固相萃取柱，用 5 mL水淋洗，2 mL 70％的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液2mL,涡旋混合，过0. 45 um有机滤膜，供高效液相色谱测定。

(2)色谱参考条件色谱柱：C18柱，5um , 250mm×4.6mm(内径)或相当者。流动相：甲醇＋0.02 mol/L乙酸铵(10+90，体积比)；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：10uL;检测波长：293 nm。

(3)测定

①标准曲线制作：将脱氢乙酸标准工作液分别注入液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以标准工作液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

②样品测定：将测定溶液注入液相色谱仪中，测得相应峰面积，根据标准曲线得到测定溶液中的脱氢乙酸浓度。

③空白试验：除不加试样外，空白试验应与样品测定平行进行，并采用相同的分析步骤分析。

5．结果计算

式中X—试样中脱氢乙酸的含量，g/kg;

ρ₁—试样溶液中脱氢乙酸的质量浓度，ug/mL;

ρ₀—空白试样溶液中脱氢乙酸的质量浓度，ug/mL ;

V—试样溶液总体积，mL;

f—过固相萃取柱换算系数(f=0.5)；

m—称取试样的质量，g。

计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

相关链接：食品中脱氢乙酸的测定（一）

文章来源：《食品质量与安全检测技术》

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