1．含量测定

HPLC法在化学药品含量测定中的应用非常广泛，在《中国药典》2010年版二部采用HPLC法测定含量的药物制剂和原料药计有1000多种，占全部品种约50%以上。

(1)复方左炔诺孕酮滴丸

色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈一水(60：40)为流动相；检测波长为220nm。理论板数按左炔诺孕酮峰计算不低于5000,左炔诺孕酮峰与内标物质峰的分离度应符合要求。

内标溶液的制备 取醋酸甲地孕酮，加乙腈溶解并稀释制成每lml中约含1mg的溶液,即得。

测定法 取本品20丸，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于左炔诺孕酮0.75mg)，置10ml量瓶中，精密加内标溶液l甜，加流动相适量，超声处理使溶解，放冷，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液20μ1注入液相色谱仪，记录色谱图；另取左炔诺孕酮与炔雌醇对照品适量，精密称定，加乙腈溶解并定量稀释制成每lml中约含左炔诺孕酮O.75／与炔雌醇O.15mg的溶液，精密量取此溶液与内标溶液各lml，置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，同法测定。按内标法以峰面积计算，即得。

讨论：①本法是典型的反相键合相色谱法，等度洗脱色谱条件，操作简便。

②选择和本品中待测组分结构相近的醋酸甲地孕酮作为内标物，可使色谱峰的保留时问相近，色谱条件易于优化统一。

③综合内标和待测组分的紫外吸收特征，选择测定波长为220nm。

(2)甘油果糖氯化钠注射液

色谱条件与系统适用性试验 用磺酸基聚苯乙烯与二乙烯苯共聚体阳离子交换树脂H型为填充剂，0.04mol／L磷酸溶液为流动相，检测波长为200nm，柱温：50℃。出峰顺序为氯化钠，果糖、甘油，理论板数按氯化钠峰计算不低于2500，各峰之间的分离度均应符合要求。

测定法 精密量取本品5ml，置100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取氯化钠、果糖和甘油对照品适量，精密称定，置同一量瓶中，加水溶解并定量稀释制成每lml中分别约含9mg、50mg与100mg的溶液，精密量取5ml，置100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。

讨论：①氯化钠是无机离子化合物，难以用键合固定相正反相色谱法洗脱，采用离子交换色谱法可分离测定氯化钠、果糖和甘油的含量，操作简便。

②氯化钠、果糖和甘油等几乎没有紫外可见吸收峰，故选择紫外区的末端吸收测定。

③流动相的盐浓度较大，可削弱了氯化钠离子的竞争吸附能力，使其易于从柱中洗脱。

2．有关物质

(1)头孢克洛中有关物质

取本品约50mg，精密称定，置100ml量瓶中，用O.27％磷酸二氢钠溶液(pH2．5)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密量取1ml，置100ml量瓶中，加O.27％磷酸二氢钠溶液(pH2.5)稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。照高效液相色谱法测定，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A为0.78％磷酸二氢钠溶液(取磷酸二氢钠7．8g，加水溶解并稀释至1000ml，用磷酸调节pH至4.0)，流动相B为O.78％磷酸二氢钠溶液(pH4.0)一乙腈(55：45)，流速为每分钟l.0ml，按下表进行线性梯度洗脱；检测波长为220nm。分别取头孢克洛对照品和头孢克洛δ—3一异构体对照品适量，用0．27％磷酸二氢钠溶液(pH2.5)溶解并制成每1ml中分别含25μg和50μg的混合溶液，取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，头孢克洛峰的保留时间约为23分钟，头孢克洛峰与头孢克洛δ—3一异构体的分离度应不小于2.O，头孢克洛峰的拖尾因子应小于1.2。取对照溶液20μ1注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的25％，精密量取供试品溶液和对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液色谱图中如有杂质峰，单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的O.5倍(O.5％)，各杂质面积的和不得大于对照溶液主峰面积的2倍(2.0%)，供试品溶液中任何小于对照溶液主峰面积O.1倍的峰可忽略不计。

讨论：①测定杂质的该法是不加校正因子的主成分自身对照法，基于供试品中各杂质在此流动相和测定波长下，具有和头孢克洛相似的紫外吸收贡献。

②头孢克洛和头孢克洛δ—3一异构体混合溶液分离试验的目的是对色谱系统适用性进行评价，以保证分离度和拖尾因子达到要求。

③采用自身对照法时，对照溶液的浓度和杂质的总量相对应，两者的峰响应也相一致。将对照溶液的主成分色谱峰的峰高调节为满量程的10-30％，以保证供试品中杂质的检测灵敏度。随着计算机的应用日益普遍，模拟信号式积分仪也不多见使用，使用现代色谱仪，可通过调节对照溶液的主成分的峰响应以达到杂质检出的灵敏度要求。

(2)肝素钠有关物质检查

测定法：取本品适量，精密称定，用水溶解并定量稀释制成每lml中约含20mg的供试品溶液；取肝素钠对照品与硫酸皮肤素对照品适量，精密称定，用水溶解并定量稀释制成每lml中各约含肝素钠20mg和硫酸皮肤素1mg的混合溶液，作为对照品溶液。照高效液相色谱法(附录V D)测定，以烷醇季铵的乙基乙烯基苯一二乙烯基苯树脂为填充剂(如ASII阴离子交换柱，2mm×250mm，与AGII保护柱，2mm×50mm)；以0.04％磷酸二氢钠溶液(用磷酸调节pH值至3．0)为流动相A；以高氯酸钠与一磷酸盐溶液(取高氯酸钠14g，用0.04％磷酸二氢钠溶液溶解并稀释至100m1,用磷酸调节pH值至3.O)为流动相B；流速为每分钟0．22ml；检测波长为202nm。按下表进行线性梯度洗脱。取系统适用性试验溶液(取硫酸皮肤素对照品、多硫酸软骨素对照品与肝素钠对照品适量，加水溶解并制成每lml中各含硫酸皮肤素0.02mg、多硫酸软骨素0.02mg和肝素钠20mg的混合溶液)10μ1，注入液相色谱仪，记录色谱图，硫酸皮肤素、肝素钠和多硫酸软骨素的保留时问分别约为20分钟、30分钟和50分钟。硫酸皮肤素峰与肝素钠峰的分离度应大于1.0，肝素钠峰与多硫酸软骨素峰的分离度应大于1.5。精密量取供试品和对照品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
供试品溶液色谱图中如有杂质峰，与硫酸皮肤素对应的色谱峰的面积不得大于对照品溶液中的硫酸皮肤素峰面积(5 O％)；主峰后其它杂质按面积归一化法计算，不应大于3.0％。

讨论：

①肝素中的有关物质多为多糖类物质，采用一般色谱方法难以分离，曾采用毛细管电泳法分离测定，但重现性较差，2010年版药典参照美国药典方法，采用离子色谱法分离测定，取得较满意的结果。

②中国药典采用紫外末端吸收202nm波长处检测，和美国药典采用紫外检测方法一致。实际上，也可采用其他检测器如电导检测器。