色谱条件的优化，在色谱柱确定之后，流动相的种类和配比显著地影响着溶质的分离。因此，HPLC分离优化的关键是流动相的最优化。

进行流动相的优化时，首先需要确定优化指标，以此来评价色谱分离的质量并预测优化可能的方向。已建立的色谱优化指标可基于以下两点考虑而设计：

①满足最难分离物质对实现理想分离前提下的快速分离；
②实现最大分离效能前提下的快速分离。

这些优化指标只能在一定程度上反映色谱分离的质量，其共同点是不能给出色谱分离的整体优化点，这样优化的结果常常是区域性的。

应用于色谱分离的最优化方法大致可分为两类：一类是解析法和半解析法，另一类是黑箱法。所谓的解析法是利用色谱参数与优化指标之间的精确关系式进行优化,从理论上讲，其优化精度可达到无穷高，代表方法是“窗口图解法”；所谓半解析法是利用多项式逼近色谱参数与优化指标间的关系来进行优化，一般是预先设计好实验方案，然后通过实验结果拟合响应面求极值，其优化精度取决于多项式和拟合精度，代表方法是“混合液设计统计技术”和“重迭分辨率图法”；所谓黑箱法是不管色谱参数与优化指标之间的关系，而纯粹从实验角度寻优，一般实验前仅设计少部分实验，通过每次实验预测优化的可能方向，然后设计新的实验，重复该步骤直至寻找到最优解，其优化精度取决于实验的次数，代表方法是“单纯形法”。