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HPLC仪器实践中具有实际使用价值的100个问题(一)

发布时间:2018-07-03 00:00 作者:中国标准物质网 阅读量:1078

1.使用HPLC时为什么要选择最佳仪器条件?

答:HPLC是集光学、机械学、电子学、计算机四位一体的、技术密集的高科技产品。从仪器学理论讲,HPLC的主要性能技术指标是决定分析误差的。例如:高压泵的流速(压力)会直接影响色谱峰形和峰高;色谱柱的类型和质量会直接影响分析测试的数据可靠性;流动相的pH会直接影响HPLC的色谱分辨率、分离效率和峰高;检测器的波长会直接影响HPLC的灵敏度(不同波长处被测物质有不同的摩尔吸光系数,会有不同的灵敏度);检测器的光谱带宽会直接影响分析误差,因为不同的样品要求用不同的光谱带宽测试,每个样品都有自己的最佳光谱带宽,只有在最佳光谱带宽下分析测试,才能保证误差最小;检测器的量程会直接影响色谱峰高;等等。所以,使用者要得到可靠的分析测试数据,就必须要了解影响HPLC分析误差的有关性能技术指标。只有在最佳条件下使用HPLC,才能得到最佳分析测试数据(即分析测试的数据准确可靠)。所以,使用者必须要认真选择HPLC的最佳分析条件。

2.如何确定HPLC的最佳分析测试波长?

答:从仪器学理论讲,使用各类HPLC时,特别是使用各类光学类检测器的HPLC,必须要认真选择最佳分析测试波长。因为不同波长下测试,会产生不同的分析误差,只有在最大吸收波长下测试,才能得到最小的分析测试误差。所以最佳测试波长的选择非常重要。一般来讲,要确定HPLC的测试波长有两种方法:①通过光谱仪器扫描确定;②如果分析测试工作是重复文献值,文献上肯定会给出测试波长,可以参考文献中采用的测试波长。

3.比较HPLC仪器时往往要给出色图谱,此时为什么要给出测试的仪器条件?

答:因为任何HPLC的色谱图,都是在一定的仪器条件下得到的,如果要比较两张图谱的情况,必须要在相同仪器条件下才有意义。例如,要用图谱说明仪器的灵敏度、漂移、噪声能满足使用要求,就不能使用很浓的样品,不能选用很大的量程,否则,色谱峰很高、很尖、基线很平直,其实是虚假的,不是真实情况;应该采用浓度接近检测限3倍的样品,选用仪器的最小量程(最灵敏量程),流动相组成、流速和pH都应接近实际使用情况,这时,测得的图谱才能反映仪器的真实情况。同时,为了他人能够重复这张色图谱,也必须给出仪器条件。所以,我们给出HPLC的色谱图时,一定要给出仪器的条件。否则,就像有些外商宣传他们的产品一样,HPLC的图谱很好看(因为采用最大试样浓度、最大量程,所以灵敏度、噪声、漂移都很小),但是实际使用时仪器的灵敏度、噪声、漂移等都达不到使用者的要求。如果将这种仪器测试的结果与其他HPLC仪器进行比对测试,这种给出虚假谱图的HPLC仪器肯定会败下阵来。

4. HPLC的检测限和测量限有何区别?

答:检测限是衡量HPLC的检测能力的指标,它与HPLC的噪声有关;测量限只能表达样品能否检测出来,它与噪声无关,如图6-1所示。

图6-1 检测限与检测限的区别示意图

含有30mg/L Sn和Hg溶液的吸收测定结果:二者的测定限相等,都是30ppm。但是检量限不等;Sn

的检出限为2N=20ppm; Hg的检出限为2N=2ppm主要取决于仪器的N!

5. HPLC标样的浓度如何选择?

答:标样对HPLC使用者来讲非常重要。一般选择标样的原则是选择大致在被分析样品浓度的中间偏低一点,不能太低也不能太高。例如:被分析样品的浓度大约在5.0~50.0mg/mL,则标样可以选择10~20mg/mL,这时,一般能保证得到较好的分析结果。

6.为什么会出现HPLC的标样和样品出峰时间不同的怪现象?

答:首先要看出峰时间与哪些因素有关。总的来讲,出峰时间主要与流动相的类型、流动相的pH、流动相流速大小(高压泵的压力)、色谱柱的质量、使用者的操作规范情况等有关。标样和样品出峰时间不同,有可能是高压泵的压力变化引起流动相流速变化所致,即进标样时的流动相的流速和进被测样品时的流动相的流速不同,就会产生二者出峰时间不同。如果是手动进样,则与操作者的操作是否规范(进样时推力的大小、手感等)有关。如果泵漏液也有可能产生标样和实际样品出峰时间不同的现象。

7.行业标准要求称1g样品,但是使用岛津的HPLC测不出样品?用其他仪器(包括国产HPLC)都可以检测出样品,这是为什么?

答:行业标准要求称1g样品,但是岛津仪器测不出样品或不出峰,有可能是仪器灵敏度太低或噪声太大(信噪比太小)。岛津的HPLC有时噪声很大,从仪器学理论来看,如果样品浓度比较小,则信号肯定会小;但是仪器的噪声是固定的,所以如果仪器的噪声大,则信噪比就小,此时仪器的检测限太小(灵敏度不够),所以不出峰。

8. HPLC仪器调0、平衡后(在纵坐标为0~20,例如10)进样,则基线从10下降到0,这种仪器正常吗?

答:HPLC的调0,应该有仪器调。和空白(流动相)调。两种。所谓仪器调0,是消除由于仪器的噪声、漂移、外界干扰等因素造成的仪器。点不在原位的情况,主要是通过仪器的光学、机械、电子学、计算机等来实现仪器归0。所谓空白调0,就是利用空白溶液(流动相)校正仪器测试样品前的综合。点。这里说的“仪器调0、平衡后(在纵坐标为0~20,例如10)进样”,提法有些不妥;因为从仪器学理论来看,此时的HPLC仪器还没有真正调好0,应该是“仪器平衡后,调0”,再进样。因为“仪器调0,平衡后”,这里只是调了仪器的机械。点(只是进行了仪器调0),并没有调空白0(流动相平衡后的0的综合0点)。也就是说,这里没有调HPLC的综合0点。因此,进样后基线就会从10下降到0。应该说仪器本身不会有什么问题,可能从10下降到。是巧合,因为也可能不一定是从10降到0,而是降到其他数值上。

这个工作正确的处理方法应该是:首先,在没有调0之前,先平衡仪器,待平衡后再调0。或者是先调一次0(这是调的仪器的0点),平衡仪器后再调0(因为第一次调0是调的仪器的机械0点,而平衡后进行第二次调。是调的综合0点或包括流动相平衡后的综合0点)。如果HPLC经过平衡后没有调综合0点,实际上HPLC系统没有处在真正的0点上,所以进样后会出现非正常的现象。这种现象与HPLC仪器应该没有什么关系。

9. HPLC的高压泵在工作,但是响声大,不出液,为什么?

答:可能是高压泵本身出现故障造成的。具体原因可能有:气泡从输液入口进入了高压泵头,拧紧泵头入口压帽即可解决;高压泵头中存在空气,在泵头中灌注流动相,打开放空阀,在最大流量下开泵,直到没有气泡出现为止;单向阀方向颠倒,按正确方向安装单向阀即可;单向阀已坏,更换单向阀即可;溶剂储液瓶已空,灌满储液瓶即可。

10.安徽黄山的科技工作者问:岛津的HPLC仪器测试标准样品时数据偏大很多,应该如何解释、如何验证?

答:首先,应该从仪器学理论角度来看为什么岛津的HPLC测试标准样品时数据偏大。标准样品一般都不是很浓(而是较稀),测试数据偏大时,多数是因为仪器的噪声偏大所致,因为仪器的噪声有多大,分析测试数据中就会增加多大的误差。仪器的噪声大,灵敏度(检测限)就会差,特别是样品很稀时,噪声是HPLC分析测试误差的主要来源之一,噪声大,则仪器的信噪比小。而岛津的HPLC的噪声表面上很小,但是它是经过计算机平滑后测出的。表面上噪声很小,但实际上硬件中的噪声还是很大,这个噪声将作为分析测试数据的一部分,在总的分析测试数据中表现出来,所以岛津的HPLC在测试标准样品时有时数据会偏大。

验证的方法有三种:①选择同类同档次的其他公司的HPLC,在相同条件下对该标准样品进行测试,将测试的数据进行比较;②改用其他方法测试(内标法、外标法等),如果数据基本不变,说明是仪器问题;③采用统计方法测试,如果趋势不变,说明仪器有问题。

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