当用可见光吸收光谱法进行测定时，要选择正确的测定条件，才可获得高灵敏度和适当的选择性，并保持定量测定结果的准确度和精密度。

一、入射光波长的选择

当用分光光度计进行测定时，应先作出吸收曲线，选用吸收曲线上最大吸收波长进行测定。入射光波长的选择必须从灵敏度与选择性两方面来考虑，当无干扰元素时，应选择最大吸收波长处进行测定，这样灵敏度最高，偏离朗伯一比尔定律的程度较小。但当有干扰元素时，就必须同时考虑选择性的问题，以达到选择最适宜的波长。例如，用丁二肟比色法测定样品中的镍时，丁二肟镍的络合物的最大吸收波长为470nm左右(图5-13)。样品中铁用酒石酸钾钠掩蔽后，在该波长下也有吸收，干扰镍的测定。为消除铁的于扰可选择波长大于500nm处测定。可选择波长为520nm处来测定镍，虽然此时测定的灵敏度有所降低，但是干扰小得多。

图5-13吸收曲线
1-丁二酮肟镍的吸收曲线；2-酒石酸铁的吸收曲线

二、参比溶液的选择

用参比溶液调节分光光度计的吸光度为0，然后测定试样溶液或标准溶液的吸光度值。参比溶液的作用除了消除吸收池壁对入射光的反射和散射等影响外，合理选用时还可消除其它干扰，使测得的吸光度正确反映被测物的浓度，提高测定的准确度。

选择参比溶液可分为以下几种情况：

①溶剂参比显色剂及其它试剂均无色，被测溶液中又无其它有色离子时，可用溶剂(如蒸馏水或其它有机溶剂)作为参比溶液。

②试剂参比显色剂本身有颜色，可用不加试样的其它试剂作为参比溶液。

③试液参比显色剂无色，被测溶液中有其它有色离子，可采用不加显色剂的被测溶液作为参比溶液。

④其它参比当显色剂有色，试液中的有色成分干扰测定时，可在一份试液中加入适当的掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，然后加入显色剂和其它试剂，以此作为参比溶液。另一种方法，是用不含被测组分的试样，与被测试样同时进行相同的处理，得到平行操作参比溶液。如血液中药物浓度监测，取不含药物的血样制备平行操作参比溶液。

三、吸光度范围的控制

从吸光度测量误差来考虑，不同的吸光度读数对测定带来不同的误差。已推导出如下的关系：

式中—浓度的相对误差；

△T—透光率的绝对误差。

由上式可以求出当T=0.368 (A=0.434)时，浓度的相对误差最小(△T＝±0.5％时，△c/c约为1.4％)。

一般分光光度计的△T约为±0.2％～±2％，若假定为0.5％，由上式可算出不同透光率时的浓度相对误差，如表5-4所示。

表5-4不同T(或A）时的浓度相对误差(假定△T＝±0.5％)

一般来说，当透射比为15％～65％(吸光度0.2～0.8)时，浓度测量的相对误差较小，这就是适宜的吸光度范围。为此可采取如下办法：

①调节溶液浓度当被测组分含量较高时，称样量可少些，或增大稀释倍数。

②使用厚度不同的吸收池因吸光度A与吸收池的厚度L成正比，因此增加吸收池的厚度吸光度值亦增加。

例某样品中镍含量约0.12％，用吸光光度法测定，若样品溶解后转入100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，在波长470nm处用1 cm吸收池测量，希望此时测量误差最小，应称取多少试样？(Ni相对原子质量为58.69, ε=1.3×10⁴，测量误差最小时的A值为0.43)

解 根据

100mL溶液中镍的质量＝(3.3×10^-5×100×58.7/1000)g＝1.94×10^-4 g

需称取试样的质量为x=(1.94×10^-4/0.0012)g=0.16g。

四、狭缝宽度的选择

在定量分析中，狭缝宽度直接影响测定的灵敏度和工作曲线的线性范围。狭缝宽度太大，灵敏度下降，工作曲线的线性范围变窄；狭缝宽度太小，入射光强度太弱，也不利于测定。一般在不减小吸光度时的最大狭缝宽度，就是应该选取的合适的狭缝宽度。