一、基因克隆概述

水稻和拟南芥等模式植物完成基因组测序后，有关基因的研究转向对基因功能的研究。基因功能研究的目的也就是要回答以下一些问题：①基因本身的结构如何，位置在哪里，拷贝数如何；②基因本身的表达特点如何，是否具有基因表达的组织性和发育阶段的特异性，在整个生物生长发育不同阶段的功能是什么；③该基因的突变、缺失等对生物体可能造成的影响等。可以看出，有关基因的克隆不再是单纯获得一段DNA序列或者cDNA序列的问题，而是对整个基因以及在植物整个生长发育网络中功能与角色的全面认识。

很显然，要认识基因的功能及其在整个生物网络中的作用的前提是获得基因的序列。如前文所述，基因的表达可以产生不同的产物甚至没有表达产物，因此基因序列既可以是DNA序列，也可以是cDNA序列。

由于多个植物基因组序列的完成，基因克隆的方法已经从开始的几种发展到现在的数十种。根据不同基因其克隆方法不同，可将现有基因克隆方法归纳为以下五大类(表8-2):①以已知序列为基础的基因克隆方法；②以分子标记连锁图谱为基础的基因克隆方法；③以人工突变体为基础的基因克隆方法；④以表达差异为基础的基因克隆方法；⑤利用生物信息学手段的基因克隆方法等。这些方法包括现在基因克隆过程中的主流方法，下文中就对其中的一些常用方法进行介绍。

表8-2基因克隆常用方法与手段

二、基因克隆方法

(一)以已知序列为基础的基因克隆方法

以已知序列为基础的基因克隆方法是指在已经知道待克隆基因的氨基酸或者核苷酸序列的基础上分离基因全长的方法。

1．以氨基酸序列为基础的基因克隆方法

在自然界的进化过程中，蛋白质编码的氨基酸存在着保守区段，这些保守区段在不同生物的种、属之间，甚至在不同门的生物体之间存在着高度的同源性。如果在某一种生物体内某基因(如乙醇脱氢酶基因)已经被克隆，可以利用该基因保守区段的对应核苷酸为探针筛选基因组／cDNA文库，或者利用RACE方法扩增基因的全长cDNA。

利用同源片段为探针筛选文库中的阳性克隆，进而克隆基因的步骤包括以下几个基本过程：基因组文库的构建、阳性克隆的筛选、阳性克隆的插入片段测序和功能基因的鉴定。

(1)基因组文库的构建。

(2)阳性克隆的筛选：以同源片段为探针筛选噬菌体文库为例。将插入有外源cDNA片段的噬菌体文库按照一定的密度平铺在培养皿上，噬菌体经过8～12h生长，长大到1～3mm直径时就可以进行平板的影印和转移。对120mm直径的培养皿而言，此时每个平板噬菌斑的数目在5000～10000个比较适宜。在确定了尼龙膜与平板的方向以后，通过影印的方法就可以将噬菌体转移到尼龙膜上。尼龙膜上的噬菌体经过碱的裂解以后可以与32P或者荧光标记的探针进行杂交。杂交获得的阳性点与平板上的阳性噬菌体斑点相对应就可以获得候选基因克隆。

(3)阳性克隆的插入片段测序。将获得的阳性噬菌体斑点平铺在新的培养皿上，利用步骤(2)的方法重新筛选直到获得的克隆数目在100个以下。根据不同载体上的测序引物，对获得阳性克隆的插入片段进行测序分析。

(4)功能基因的鉴定。利用超量表达或者RNAi抑制的方法确定所克隆基因的功能。

2．同源序列法与RACE-PCR扩增基因全长cDNA

RACE是快速扩增cDNA末端(rapid amplification of cDNA end)的英文缩写。RACE是在20世纪80年代发展起来的一种PCR技术，也是目前大多数实验室经常采用的一种基因克隆方法。

RACE技术的基本过程包括5’端RACE,3‘端RACE、序列分析与拼接和全长cDNA的获得4个过程(图8-6)。

(1) 5‘端RACE。5'RACE反应又可以分为以下的几个步骤，即mRNA反转录为一条链的cDNA；然后利用5'cDNA的帽子结构设计的引物分别与基因的特殊引物进行PCR嵌套扩增获得一条或者几条特异的PCR带型；分别将这些PCR产物克隆到质粒载体上进行PCR测序，通过分析和比较就可以获得待克隆基因的5‘端片段(图8-6A)。

(2) 3’端RACE。3’端RACE-PCR扩增的原理与5‘端RACE-PCR的扩增原理基本相似。利用已知区段的序列设计出基因的特异引物，转换为cDNA的尾巴poly (T)n(图8-6B)。

(3)序列分析与拼接。通过对cDNA两端的PCR扩增获得了待克隆基因的上游和下游序列以后，利用分析软件将两个片段进行拼接，在拼接的过程中将重叠的片段剔除掉就可以获得理论上的全长基因。

(4)全长cDNA的获得。由于PCR扩增的错误性和基因存在着不同的基因家族的可能性，这个拼接以后的全长基因还必须进行分析验证，即按照理论上的全长基因分别设计出可以扩增出全长基因的一对引物，利用这对引物扩增基因的全长片段，将该片段进行克隆测序以后就可以得到待克隆基因的全长cDNA序列。

以同源序列为基础进行基因的克隆是基因克隆手段的一个重要方面，特别是多个不同的模式植物的基因组完成测序以后，根据不同生物的基因进化特点和保守性，利用微生物或者人类基因组中已经克隆基因的保守区段在植物上进行同源基因的克隆十分有效，或者同一个科或属的不同植物之间由于基因在染色体上存在着同线性和共线性的特点，使得利用同源克隆的方法更加快速。

(二)以分子标记连锁图谱为基础的

基因克隆方法

以分子标记连锁图谱为基础的基因克隆方法是分子标记发展的一个重要成果。以分子标记连锁图谱为基础的基因克隆又可以称为图位克隆(map-based cloning)或者基因定位克隆(positional cloning)方法。图位克隆方法的主要原理是根据基因在图谱上的相对位置并利用染色体步移进行基因克隆的一种方法。目前利用图位克隆方法已经在多种生物中克隆到大量的基因，如拟南芥的RPM1基因和水稻的Xa21基因等。

图8-6RACE-PCR方法克隆基因的基本过程

A, B分别表示利用RACE PCR快速扩增目的基因的3’端和5‘端

图位克隆包括5个基本步骤（图8-7)。

(1)紧密连锁标记的获得：通过遗传分析或者基因组连锁图谱的构建将目的基因定位在染色体的一定区间内，也就是说在目的基因的两侧获得若干个连锁的分子标记。通常要求分子标记与待克隆的基因连锁遗传距离为1～2cM。分子标记的紧密程度直接关系到分离目的基因的快慢程度。

图8-7图位基因克隆法的基本步骤和原理

Marker表示分子标记；Contig表示末端重叠群；Ti-DNA表示植物表达载体

(2)大片段基因组文库的构建：利用图位克隆的方法克隆目的基因的另外一个重要条件就是建立含有不同大小插入片段的基因组文库。例如，能够插入较大片段的YAC和BAC文库，插入几十kb片段的Cosmid文库以及插入小片段的质粒载体文库。这些不同大小插入片段的文库可以满足染色体步移的需要。

(3)染色体步移与重叠群的构建：通过染色体步移法分离含有目的基因的候选克隆。染色体步移的基本思路是利用分子标记分离到与分子标记同源的插入克隆，然后通过重叠群的分析获得候选基因克隆。具体步骤是：利用已知的分子标记为探针筛选到与探针同源的一个克隆，再以该克隆的末端片段为探针从文库中筛选出另外一个同源克隆。依此类推，筛选获得的克隆的插入序列与前一个克隆的插入片段具有部分重叠。每一次步移都更加靠近目的基因，类似人的“步行”，因而被称为染色体步移。经过多次染色体步移后克隆的插入片段即为目的基因。

染色体步移的方法通常以大片段的插入文库为步查的起始文库，选用这种文库可以大幅度地减少染色体步移的次数，从而减少工作量。如果选用插入片段较小的基因组文库作为染色体步移的起始文库，由于高等植物基因组中大量重复序列的存在使得染色体步移工作变得十分的艰难。

从原理上讲，染色体步移是一个比较简单的过程，并且在理论上可以分离任何一个基因。但在实际的工作中，由于每一个步骤都要求相对地精确，非常繁琐，而且比较费时和费力，因此在实际运用中对基因组比较小的植物可以采用，而对于基因组比较大的植物就显得非常困难。

(4)目标克隆的测序：将获得的BAC或者其他克隆进行测序和拼接，利用生物信息学和遗传学的方法确定候选基因。选取若干个候选基因的片段作为探针，根据探针在分离群体中与目的性状的连锁情况确定探针是否与表型发生共分离。如果分子标记探针与表型发生共分离，则要同时结合其他分子生物学辅助手段确定候选基因。

(5)候选基因的功能鉴定：通过功能互补分析、基因功能的缺失或者基因的移位等方法来分析基因的功能并最终克隆基因。

图位克降虽然步骤繁多，但是由于该方法是从基因的表型出发能够分离到新的基因，原创性强。