(一)分离花粉的方法

1．自然释放法

有些物种的花蕾经消毒后在无菌条件下取出花药，放在液体或固体培养基上培养，花药会自然开裂，将花粉散落在培养基里(上)，然后将花药壁去除，进行花粉培养。这种方法在油菜和几种禾本科植物里有所应用，但由于效率低，一般不采用。

2．研磨过滤收集法

这种方法只在茄科和油菜里有成功的应用。将花蕾消毒后放入含培养基或分离液的无菌研磨器中研磨，使花粉(小孢子)释放出来，然后通过一定孔径的网筛过滤，离心收集花粉并用培养基或分离液洗涤，然后用培养基将花粉调整到理想的培养密度，移入培养皿培养口油菜小孢子分离技术程序见图5-5。

图5-5油菜小孢子培养流程图

3．剖裂释放法

这一技术需要借助一定工具剖裂药壁，使花粉、愈伤组织或胚释放出来，而不是自然释放。这种方法最早在烟草里尝试，后来在Pennisetum typhoide、里成功应用。显然，这种方法比自然释放法费时。

(二)花粉／小孢子培养方法

1．液体浅层培养

这一方法类似于原生质体培养，分离的小孢子经洗涤纯化后调整到需要的浓度，根据培养皿的大小，适量加入培养皿中进行培养。待愈伤组织或胚状体形成后转移到分化或胚发育的培养基上生长。

2．平板培养法

分离的花粉在平板培养基上培养也可以诱导产生胚状体，并进而分化成小植株(Nitsch et al.，1973)。

3．看护培养法

Sharp等(1972)建立了一种看护培养法，通过培养形成了番茄的细胞无性繁殖系。这种方法是将滤纸片放置在完整花药的上面，将花粉放置在滤纸片上。对照把花粉粒直接放在固体培养基表面上，其他操作完全相同。花粉在看护培养基上植板率可达到60％，而对照的花粉不生长(图5-6)。

图5-6花粉看护培养

4．微室悬滴培养法

Kameya等(1970)用甘蓝×芥蓝F₁代的成熟花粉培养获得植株。其方法是把F1代花序取下，表面消毒后用塑料薄膜包好，静置一夜，待花药裂开、花粉散出，制成每滴含有50～80粒的花粉悬浮培养基，然后进行悬滴培养，培养方法类似于原生质体培养，见图5-7。

图5-7花粉微室悬滴培养

5．条件培养法

在合成培养基中加入失活的花药提取物，然后接入花粉进行培养。首先将花药接种在合适的培养基上培养一定时间(如1周)，然后将这些花药取出浸泡在沸水中杀死细胞，用研钵研碎，倒入离心管离心，上清液即为花药提取物。提取液过滤灭菌后加入培养基中，再接种花粉进行培养。由于失活花药的提取物中含有促进花粉发育的物质，有利于花粉培养成功。