β-内酰胺类抗生素是一类结构中含有β-内酰胺环基本结构的药物总称，主要包括青霉素类（penicillins, PENS)、头抱霉素类（cephalosporins, CEPS，又称先锋霉素）。在抗生素的发展史上，β-内酰胺抗生素是最悠久的一类抗微生物药物，首次用于人类治疗的β-内酰胺类抗生素是从霉菌中分离出来的，尤其是青霉菌。早在公元前3000年就有关于霉菌的抗菌性的记载，有中国人利用发霉的大豆来治疗感染的伤口；在公元前16世纪，一位希腊农妇使用从奶酪上刮的霉菌治疗受伤的士兵；另外，在公元前1550年，埃及有文献记载使用变质的大麦面包治疗感染伤口；公元前2世纪，斯里兰卡士兵将发霉的油饼作为药膏涂抹在伤口上，采用上述方式产生的霉菌进行治疗一直持续到19世纪。直到19世纪后半期，人类开始对青霉素菌属进行研究，特别是在其抗菌性方面。现如今主要是用于预防和治疗由葡萄球菌、肺炎球菌、链球菌、大肠杆菌、嗜血杆菌、沙门氏菌等引起的动物尿道胃肠道和呼吸道感染的疾病。该类抗生素的结构特点是含有自然界中罕见的β-内酰氨基母核，按照母核结构的差异可分为青霉素类、头孢霉素类、头霉素类（甲氧头孢，oxacephems),碳青霉烯类（carbapenems）和单环价内酰胺类，其中前两者发展最快，应用最多，结构如图5-9所示。

图5-9β-内酰胺类抗生素的结构

从图5-9中可以看出，β-内酰胺类抗生素具有以下结构特征：首先，基本结构都由母核和侧链两部分组成。母核结构是一个四元β-内酰胺环，内酰胺环中的N原子与临近的三个C原子以及第二个五元环或者六元环相稠和，青霉素类的稠和环是氢化噻唑环，母核结构是6-氨基青霉硅酸；头孢霉素类的稠和环是氢化噻嗪环，母核结构为7-氨基头孢霉烷酸。其次，C-6,C-7位含有酰胺基侧链（RCC)HN-)。另外，该类抗生素的母核结构中的两个稠环是不共面的，青霉素类的是沿N₁-C₅轴折叠，头孢菌素类的是沿N₁-C₆位折叠。青霉素类全合成是难以实现的，主要是因为青霉素类含有三个手性碳原子，8个旋光异构体中只有绝对构型为(2S,5R,6R）具有活性。头孢霉素类有4个旋光异构体，绝对构型为（6R,7R)。β-内酰胺抗生素的抗菌活性不仅与母核的结构有关，而且还与位于酰胺基上取代的手型碳原子有关，因为旋光异构体的活性存在很大差异。

β-内酰胺类抗生素是有极性的，在水中具有一定的溶解性。在酸性或者碱性环境中的溶解性主要取决于居内酰胺类的侧链的属性，该类抗生素的母核结构中含有游离的羧基，呈酸性，在pKa为2.5～2.8之间时，能与无机盐或者某些有机碱形成钠盐或者钾盐，而侧链带有氨基的居内酰胺化合物则属于两性化合物。因此，β-内酰胺的盐类在pH=6～7时最稳定，两性化合物在等电点时最稳定。

青霉素类抗生素是β-内酰胺类抗生素的重要组成部分，其分为天然抗生素类与半合成抗生素类，其中天然合成青霉素是由青霉素菌发酵产生的，含有青霉素F,G,X,K和双氢F五种成分，其中青霉素G是作用最强并且产量也最高的一类青霉素，主要是用于革兰氏阳性菌，如葡萄球菌、肺炎链球菌、脑膜炎链球菌、白喉杆菌、炭疽杆菌、破伤风杆菌等引起的各种感染。半合成类青霉素是在G-APA基础上进行改造形成的一类青霉素，其中包括苯唑西林（oxalcillin),氨苄西林（ampicillin)、阿莫西林（amoxicillin）等。其中常见的天然或者半合成的青霉素类抗生素的化学结构见表5-4。

表5-4常用的天然与半合成青霉素类抗生素的化学结构

(1) β-内酰胺类抗生素的作用机制

β-内酰胺类抗生素是一种杀菌性抗生素，它不仅能够有效地作用于生长、繁殖的细菌，而且还能够有效地杀死处于静止期的细菌。但是现如今，关于抗生素作用机制众说纷纭，不同结构的β-内酰胺类抗生素是否具有相同的作用机制等基础性问题仍未阐明。本部分将以青霉素为例主要介绍经历“微生物形态学一生物化学一分子生物学”过程的作用机制。

自1929年Fleming发现青霉素以来，人类对户内酰胺类抗生素的作用机制研究的第一阶段主要集中在对其活性和生态学的观察，其中早期的研究成果主要有三个：①发现了当革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌同时存在时，青霉素对前者的活性要高一些；②发现青霉素能够快速杀死分裂时的细菌而对静止期的细菌没有作用；③青霉素能够诱导细胞形态的改变，在后期的研究中这一现象称为细胞壁的完整性遭到破坏。

第二阶段的研究主要是人类对细菌细胞壁组成的深入研究。研究人员通过对青霉素作用之后的细菌的细胞壁成分的研究，提出了黏肽的结构，发现细胞的细胞壁中存在着大量的D-Ala成分和游离的氨基酸基团。由此推测，青霉素的作用机制可能是抑制了黏肽交联过程中转肽反应，这种抑制作用发生的原因是青霉素分子与乙酞-D-AIa-Ala的分子结构类似，竞争性地与酶的活性中心结合，抑制转肽酶对D-Ala-D-Ala底物的转肽作用，从而阻止细胞壁肽聚糖交联的形成。

β-内酰胺类抗生素作用机制研究的第三阶段的主要研究结果是，其能够与细菌细胞膜上的青霉素结合蛋白（penicillin binding proteins, PBPs）结合而妨碍细菌细胞壁黏肽的合成，使其不能够交联而造成细胞壁的缺损，致使细菌细胞壁破裂死亡。此外，触发细菌的自溶酶活性还会引发细菌的致病效应，缺乏自溶酶的突变菌株表现为耐药性。β-内酰胺类抗生素是一种杀菌性抗生素，杀菌过程发生在细菌细胞的繁殖期，只是在细菌分裂后期细胞壁形成的短时间内有效，由于哺乳动物没有细胞壁，不受居内酰胺类药物的影响，所以本类药物具有对细菌的选择性杀菌作用，对宿主细胞的毒性比较小。β-内酰胺类药物的作用靶位是细菌胞浆膜上的特殊蛋白PBPs，各种细菌细胞膜上的PBPs的数目、分子量以及对β-内酰胺类抗生素的敏感程度不同，但分类学上相近的细菌，则其PBPs类型及生理功能相似。例如，大肠杆菌有七种PBPs, PBP_1A, PBP_1B：与细菌延长有关，青霉素G、头孢噻吩等与PBP_1A, PBP_1B有高度亲和力，可使细菌的生长繁殖和延伸受到抑制，并溶解死亡，PBP₂与细管形状有关，亚安培南与氮眯青霉素能选择性地与其结合，使细菌形成大圆形细胞，影响细胞渗透性的稳定性，导致细胞溶解死亡。PBP₃与PBP_1A、相同，但数量小，其与细菌分裂有关。大多数青霉素类或头孢菌素类抗生素主要与PBP₁：和PBP₃结合，形成球形体和丝状体，使细菌发生变形萎缩，逐渐溶解死亡。PBP₁,PBP₂,PBP₃是细菌存活，生长繁殖所必需的，PBP₄,PBP₅,PBP₆与羧肽酶活性有关，对细菌的生存繁殖不重要，抗生素与之结合后，对细菌的存活影响。此类药物与四环素类、大环内酯类、磺胺类等抗生素同时使用时，降低此类药物的杀菌作用。

2007年，Kohanskirfi发表在Cell杂志上的研究成果表明杀菌性抗生素与细菌接触后，能够引发细菌产生大量的羟基自由基。这些羟基自由基导致细菌胞内大分子组成的破坏（如DA、蛋白质、细胞膜等），这是杀菌性抗生素的共同作用机制：但是，ImlavL等，Lewis等以及Barras等相继在2013年的Sci-once杂志上发表文章，证明杀菌性抗生素能够杀死细菌与羟基自由基无关，并指出Kohanski等以前的相关研究在方法学上存在一定问题。由此，杀菌性抗生素诱导产生“羟基自由基的共同杀菌机制”的理论受到挑战，也暗示了“杀菌性抗生素的共同作用机制”理论至今没有应用价值的原因，有关于抗生素的作用机制、细菌产生的耐药机制等问题还没有得到更加准确的阐明，说明现在关于作用机制的基础研究还不够，因此，关于价β-内酰胺类抗生素作用机制的研究是急需解决的重要问题。

(2) β-内酰胺类抗生素残留的危害及现状

若长期使用、滥用或者不按休药期使用β-内酰胺类抗生素用于动物疾病的预防和治疗易造成在动物体内的残留，其残留量对健康和生态的影响主要有以下几点：①产生耐药性，细菌的耐药基因通常是位于R-质粒上，R-质粒在细胞质中能够进行复制，也就意味着能够遗传，又能通过传导在细菌之间转移和传播。细菌的耐药性具有加合性，且容易遗传和扩散，这些耐药菌株给兽医治疗和医学临床提出了极大的挑战，同时还降低了药物的市场寿命，当这些耐药菌株通过食物链传递给人类时，又会给人类感染疾病的治疗带来不良的影响；②菌群失调，兽药残留会导致人体内的正常菌群紊乱，同时还会干扰耐药的病原菌株，使人体肠道内的菌群失调；③变态反应，以青霉素为主体的β-内酰胺类抗生素使用量极大，其代谢或者降解产物具有较强的致敏作用，轻者会导致皮炎、皮肤瘙痒，严重者会导致虚脱，甚至死亡；④对环境的影响，食用过β-内酰胺类抗生素的动物，其排泄物中的抗生素和耐药菌株会被释放到环境中污染土壤和水源，在污泥中细菌可长期生长同时保持耐药性。

虽然β-内酰胺类抗生素在人体和动物疫病的防治方面具有很好的疗效，应用十分广泛，但是由于其对人体及环境的危害以及耐药菌株的出现，现很多国家开始对其的使用量以及在动物源食品中的残留量进行严格的控制。其中美国和欧盟国家已经提出禁止抗生素含量超标的产品上市，其中美国FDA规定青霉素G的残留＜5ng/mL，阿莫西林、氨苄青霉素和氯唑青霉素残留＜10ng/mL,头孢吡林残留小于＜20ng/mL。但是为了避免消费者受到食品中抗生素残留的危害，保护人类的身体健康，各个国家都开始制订最高残留限量，并且随着各种精密仪器的出现，国家对残留限量的标准也是越来越严格，另外，我国也制订并公布了β-内酰胺类抗生素的最高残留限量。其中部分β-内酰胺类抗生素残留限量见表5-5。

表5-5我国规定的部分β-内酰胺类抗生素最高残留限量

(3) β-内酰胺类抗生素的检测

β-内酰胺类抗生素是目前阳性检出率最高的一类药物。在样品检测技术上，目前国内外的发展趋势是向着多残留检测技术方法，并以高效液相和液质联用技术为主。

①样品的前处理。前处理是样品检测过程中重要的一环，前处理一是为了最大限度提取待测目标物，而且还要减少杂质、降低干扰、降低检测限。目前，各种各样的前处理方法相继出现，本章节将介绍几种常见的方法以及在常见方法的基础上进行的优化。

a．液-液萃取。此方法的原理在前面章节中已经具体介绍过，本章节就不再具体介绍，该方法操作费时、并且选择性较差、消耗高纯溶剂多，显然不符合现代仪器分析的发展趋势，目前的使用已逐渐减少。近几年液-液分散微萃取技术被提出，它具有操作简单、快速、准确、近几年取得了较大的研究进展。Junza等在建立了同时测定牛乳中包含的14种β-内酰胺类抗生素在内的31种抗生素的DLLME-HPLC-MS/MS检测方法，该方法的检测限为4.1～104.8ng/g，并且回收率高达72％～110％。

b．磁性固相萃取技术（magnetic-solid phase extraction, M-SPE)是在固相萃取技术的基础上发展起来的萃取技术，该技术的吸附剂是磁性或者可以被磁化的物质，具有操作时间短，萃取能力强等优点。Liu等采用的是C18修饰的磁性核壳介孔球作为SPE材料处理牛乳中的三种头孢类药物，经过后期检测，发现牛乳的定量限为0.23～0.26ng/mL。

c. QuECHERs方法。是将提取、分离和净化等步骤融为一体，可减少样品的使用量、试剂和耗材消耗、降低成本等。同时，QuECHERs已经被欧盟写进标准：EN 15662-2007, Wang等建立了QuECHERs前处理结合液质联用测定牛乳中多类兽药残留的检测方法，最终测定青霉素G和青霉素V的检测限为0.1ug/kg，定量限为0.5ug/kg。所以，QuECHERs法能够简化和优化该方法在兽药领域内的应用，符合现代分析要求。

②样品的检测。动物源食品中β-内酰胺类抗生素的检测技术已经取得很大进展，已有的实验条件已经能够使得药物的定量限和检测限满足国家出入境、食品药品监督管理局等部门的检测要求，接下来将介绍几种常见的检测方法。

目前微生物测定法按照测定原理分为三类：微生物抑制法、微生物受体法、酶比色法。该类方法对仪器的需求少、试剂消耗少、操作简单，能够筛选大批量的样品。但是使用该方法测定具体样品时，其定性能力有待进一步提高，通常只是测定总量，不具有特异性。

免疫测定法的基本原理是抗原与抗体的特异可逆性结合，其作为筛选方法非常有效，但假阳性问题经常被研究学者指出。Wang等建立了一种测定牛乳中多种β-内酰胺类抗生素的双抗体夹心酶联免疫吸附分析法，该方法的检出限低至4.17ug/L。该方法是快速检测牛乳中该类药物残留的常用方法。

液相色谱质谱法相比于串联其他检测器，其灵敏性与选择性均比较高，并且质谱技术又可以对色谱无法分离的物质进行定量分析，具有较高的灵敏度和较宽的线性范围，目前二者联用，应用广泛。但是定量时仍然需要最大限度的优化色谱条件对目标化合物进行分离，从而减轻杂质对待测物的干扰，提高灵敏度。其中Piatkowska等也建立了高灵敏度和选择性的测定鸡蛋中多类兽药残留的串联质谱方法，该法对头孢类和青霉素类定量限达到1～2.5ug/kg，能够很好地满足测定需求。

反向高效液相色谱-紫外是β-内酰胺类抗生素的一种经典的分析方法，在兽药残留检测领域应用广泛。但是反向高效液相色谱用到的DAD检测器通常情况下只能做定量分析，不能提供待测物的结构信息。另外，β-内酰胺类抗生素自身不含有荧光基团，在采用荧光检测的时候必须对其进行衍生化，基于上述原因，该类检测器在β-内酰胺类抗生素方面的应用较少。