1.分离方式的选择

高效液相色谱的分离方式非常多，对于一个待分析样品需要考虑的因素是样品的水溶性（脂溶性）、样品的极性（非极性）、分子的结构、相对分子质量的大小等。

综合考虑被测样品的物理化学性质、特点之后，可参照图7-5进行分离方式的选择。

图7-5分离方式的选择原则

2.流动相选择与处理

高效液相色谱流动相的选择取决于分离方式，对于吸附色谱常用的是正己烷、正庚烷等非极性溶剂，分离时需加入少量的极性溶剂，如异丙醇、甲醇等。对于反相色谱，最常用的是乙腈、甲醇、水等，有时需加入某种修饰剂。流动相的选择还必须与选择的检测器相匹配。当选用紫外检测器时，作为流动相的溶剂中不能含有可能被检测波长吸收的杂质（注意每种溶剂的紫外截止波长）。例如，常用的乙腈（分析纯）溶剂，常含有少量的丙酮、丙烯腈、丙烯醇和噁唑化合物，会产生较大的背景吸收，用前必须采用活性炭或酸性氧化铝吸附纯化。

不论选用何种溶剂作流动相，首先必须用0.45um的微孔滤膜过滤，以防不溶物磨损高压泵和堵塞流路、色谱柱等。过滤后应对流动相进行脱气处理，否则溶解在溶剂中的气体形成的气泡进入检测器后会引起尖锐的噪声峰，严重时会影响系统的稳定性，不能正常分析。常用的脱气方式有超声波振荡法、He鼓泡置换法、在线真空脱气法等。

3.流动相洗脱方式

在高效液相色谱中流动相有两种洗脱方式。一种是等强度洗脱，即流动相组成不随分析时间变化，始终是均一的流动相洗脱，这种方式适合于较简单的样品分析。对于复杂的样品需采用梯度洗脱的方式（类似于气相色谱中程序升温的作用），即在分离过程中按照设置的程序改变流动相的组成，目的是逐渐增加流动相的洗脱能力，使色谱柱中保留强度大的组分在流动相中的溶解度增加，从而迅速流出色谱柱，缩短分析时间。梯度洗脱的方式可以是线性的或非线性的，可以是二元或多元的，根据待分析的样品而定。

4.衍生化技术

衍生化就是将用通常检测方法不能直接检测或检测灵敏度低的物质与某种试剂（衍生化试剂）反应，使之生成易于检测的化合物。按衍生化的方式可分柱前衍生和柱后衍生。柱前衍生是将被测物转变成可检测的衍生物后再通过色谱柱分离。这种衍生可以是在线衍生，即将被测物和衍生化试剂分别通过两个输液泵送到混合器里混合并使之立即反应完成，随后进入色谱柱；也可以先将被测物与衍生化试剂反应，再将衍生产物作为样品进样；还可以在流动相中加入衍生化试剂。柱后衍生是先将被测物分离，再将从色谱柱流出的溶液与反应试剂在线混合生成可检测的衍生物，然后导入检测器。衍生化不仅使分析体系复杂化，而且需要消耗时间，因此只有在找不到方便而灵敏的检测方法或为了提高分离和检测的选择性时才考虑用衍生化法。

可见光衍生化法主要应用于过渡金属离子的检测，将过渡金属离子与显色剂反应，生成有色的配合物、鳌合物或离子缔合物后用可见光检测。

荧光衍生化法是将被测物质与荧光衍生化试剂反应后生成具有荧光的物质进行检测。

电化学衍生化法应用得较少，它是将无电活性的被测物与电活性衍生化试剂（其本身不一定具有电活性）反应，生成可在电极上产生氧化或还原反应的电活性衍生物。