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钩端螺旋体属生物学特性

发布时间:2017-09-11 00:00 作者:中国标准物质网 阅读量:3347

钩端螺旋体(Leptospira)的螺旋数目多,且螺旋细密而规则,菌体的一端或两端弯曲呈钩状。钩端螺旋体属包含13个种,可分为致病性及腐生性钩端螺旋体两大类。致病性钩端螺旋体即问号钩端螺旋体(L.interrogans),能引起人及动物的钩端螺旋体病,简称钩体病,1886年由Weil发现,故称Weil病。钩体病是在世界各地广泛流行的一种自然疫源性人畜共患病,我国绝大多数地区都有不同程度的流行,尤以南方各省最为严重,对人健康危害很大,是我国重点防治的传染病之一。腐生性钩端螺旋体包括许多来源于环境的腐生钩端螺旋体菌株。

一、生物学特性

1.形态与染色 钩端螺旋体简称钩体,长短不等,大小为(0.1~0.2)um×(6.0~20.0)um。螺旋盘绕细致而规则,在暗视野显微镜下观察,似小珍珠排列成的细链,一端或两端弯曲呈钩状,菌体呈问号、C或S形,故称为钩端螺旋体。呈移行、屈伸、翻转、滚动等特殊运动方式。革兰染色为阴性,但不易着色。常用镀银法染色,染色后螺旋体增粗,呈棕褐色,易于观察。

2.培养特性钩端螺旋体对营养要求较高,常用含10%新鲜灭活兔血清的柯氏(Korthof)培养基,兔血清除能促进钩端螺旋体生长外,还有中和代谢产物毒性的作用。本菌需氧,最适pH值为7.2~7.6,PH值小于6.5时死亡,最高能耐pH值为8.4;最适生长温度为28~30℃。若11~13℃能生长,则为肺致病的双曲钩端螺旋体。钩端螺旋体在人工培养基中生长缓慢,在液体培养基中分裂一次需6~8 h,28℃孵育1~2周,液体培养基呈半透明云雾状,但菌数仅相当于普通细菌的1/100~1/10。在固体培养基上,经28℃孵育1~3周,可形成透明、不规则、直径约2 mm的扁平细小菌落。

3.抗原成分致病性钩端螺旋体的抗原主要有两种:一种是表面抗原(P抗原),另一种是内部抗原(S抗原);前者存在于螺旋体表面,为蛋白质多糖复合物,具有型特异性,是钩端螺旋体分型的依据;后者存在于钩端螺旋体内部,是类脂多糖复合物,具有属特异性,为钩端螺旋体分群的依据。

应用显微镜凝集试验(microscopic agglutination test, MAT)和凝集素吸收试验(agglutination absorption test, AAT),可对钩端螺旋体属进行血清群和血清型分类。目前钩端螺旋体至少可分为25个血清群、273个血清型,其中我国已发现的致病性钩端螺旋体至少有19个血清群、75个血清型,是发现钩端螺旋体血清型最多的国家。

4.抵抗力对干燥、热、日光的抵抗力均较弱,60℃ 1 min即死亡。0.2%来苏儿、1:2000升汞、1%石炭酸10~30min可被杀灭,对青霉素敏感。在湿上或水中可存活数月,这在传播上有重要意义。

二、临床意义

钩端螺旋体是一种人畜共患性疾病,全世界至少已发现有200种动物为钩端螺旋体病携带者。我国已从50多种动物中检出了钩端螺旋体,其中鼠类和猪是最常见的储存宿主。动物多呈隐性感染,钩端螺旋体在感染动物的肾脏中长期存在,持续随尿液排菌污染水源、土壤等,通过与被污染物接触而感染。也可垂直传播给胎儿,导致流产。

钩端螺旋体有较强的侵袭力,以其一端或两端黏附,能穿透完整的皮肤、黏膜或从破损处侵入人体,在局部迅速繁殖,经淋巴系统或直接进入血液循环引起钩端螺旋体血症,产生一些致病物质,如内毒素样物质、溶血素、细胞毒性因子(cytotoxicity factor, CTF)等。钩端螺旋体在血液中大量繁殖并侵入肝、肾、脑膜等各种组织器官,大量繁殖的钩端螺旋体及其毒性物质、死亡钩端螺旋体可引起机体中毒,此为败血症期。患者可出现畏寒、高热、全身酸痛、眼结膜充血、淋巴结肿大等,小腿腓肠肌酸痛尤为明显。此后可引起皮肤、黏膜、肌肉、肺、心、肝、肾、脾等组织器官的出血、变性与坏死。

钩端螺旋体因血清型不同、毒力不一及宿主的免疫水平不同,故临床表现轻重相差较大,轻者似感冒,只出现轻微的自限性发热;重者有明显的肝、肾、中枢神经系统的损害,肺大出血,甚至死亡。常见的临床类型如下:流感伤寒型、黄疽出血型、脑膜脑炎型、肺出血型、肾功能衰竭型、胃肠炎型等。

三、微生物学检查

(一)检验程序

钩端螺旋体的检验程序见图24-2。

图24-2钩端螺旋体的检验程序

(二)标本采集

患者发病1周内采取血液;1周以后采取尿液;有脑膜刺激症状的患者脑脊液标本的检出率高。感染6~10天可检出抗体,3~4周抗体达最高水平。尸体、动物应取肝、肾、脑和肺送检。也可采集钩端螺旋体污染的水、土壤等作为标本。

(三)显微镜检查

1.暗视野显微镜检查直接观察标本中钩端螺旋体的形态和运动。用于早期诊断,方法简单、快速,但检出率低。取急性期患者的抗凝血先以1000 r/min低速离心10 min,除去血细胞,血浆再以10000 r/min高速离心40 min,弃上清取沉淀物制片,暗视野显微镜检查。

2.涂片、染色检查涂片后用镀银法染色镜检,也可用荧光素标记抗体快速检查钩端螺旋体,此法敏感性高、特异性强,对同群钩端螺旋体染色亮度强,对异群虽可出现交叉反应,但亮度较差,对其他微生物无交叉反应。

(四)分离培养

1.血培养取钩端螺旋体血症期患者的血液数滴接种于柯氏培养基(4.5~5 mL)进行培养,每份标本接种2~3管。若患者已用青霉素治疗,可事先在培养基中加入1500 U/mL的青霉素酶

2.尿培养尿标本一般需浓缩(离心)后培养,培养时需加抑菌剂如5-氟尿嘧啶(5-FU)等,可避免污染菌的影响;酸性尿者应在取尿的前1天晚上服小苏打2~4 g,使尿呈中性或弱碱性,以提高检出率。

3.其他标本培养如脑脊液、动物肝或肾组织块、污染的水和土壤等均可进行分离培养钩端螺旋体。

上述培养物28℃孵育2~4周,每隔3~5天用暗视野显微镜检查一次,大部分阳性标本在7~14天有生长表现,由于钩端螺旋体为需氧生长,离培养基液面1 cm内的部位钩端螺旋体最多,故培养基显现出半透明云雾状混浊,用生长良好的菌液做鉴定。用显微镜凝集试验和凝集素吸收试验鉴定其血清群和血清型。连续培养30~40天,如无生长现象,才能报告阴性。

(五)血清学检查

一般在病初和发病第3~4周采取双份血清,检测抗体滴度的动态变化。常用的血清学试验方法如下。

1.显微镜凝集试验 即用标准株或当地常见菌株作抗原,分别与患者不同稀释度的血清混合。若待检血清有相应抗体存在,可发生凝集现象,在暗视野显微镜下明显可见,若加入补体,凝集的钩端螺旋体可发生溶解现象。本试验特异性和敏感性较高,血清中特异性抗体凝集效价不小于1:300为阳性。

2.间接凝集试验 将钩端螺旋体属特异性抗原(可溶性抗原)吸附于载体(如绵羊红细胞、活性炭、乳胶颗粒等)上成为具有钩端螺旋体属特异性的致敏颗粒,这些致敏颗粒在玻片上能与患者血清中相应的抗体结合,形成肉眼可见的凝集。此方法快速、简单,但特异性不如显微镜凝集试验,可用于标本的筛选和供基层实验室使用。

3.酶联免疫吸附试验 用ELISA法和斑点-ELISA法检测患者血清中钩端螺旋体特异性抗体IgM,用于钩端螺旋体病的快速诊断,若被检血清的吸光度为阴性对照吸光度2倍或2倍以上为阳性,也可用肉眼直接观察结果。

(六)动物接种

动物接种是分离钩端螺旋体的敏感方法,尤其适用于有杂菌污染的标本。常用幼龄豚鼠和金地鼠。将标本注入动物腹腔,一般3~7天发病。第一周末取心血及腹腔液暗视野显微镜检查并做分离培养。动物死后解剖可见皮下和肺部有大小不等的出血灶,肝、脾组织显微镜检查可见大量的钩端螺旋体。

(七)核酸检查

用特异性DNA探针杂交法或PCR技术,检测标本中钩端螺旋体的核酸。此方法快速、敏感。若先用PCR技术扩增标本中钩端螺旋体的核酸,再用特异性DNA探针杂交法,可提高敏感性,但要注意防止环境中DNA的污染。

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