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菌株保存和管理

发布时间:2017-08-23 00:00 作者:中国标准物质网 阅读量:1064

微生物菌种是指可培养的有一定科学意义或实用价值的细菌、真菌细胞株及其相关信息。它是一个国家重要和宝贵的生物资源之一。因此,必须重视微生物的保存,使其尽可能不发生变异或死亡,为科学研究和实验鉴定提供良好的菌种。

一、菌种类型

(一)参考菌株

参考菌株主要用于临床微生物实验室室内质量控制,也可作为实验室培训的示教材料。实验室必须长期保存一定种类和数量的参考菌株,以满足工作需要。参考菌株的基本特性如下。

(1)形态、生理、生化及血清学特征典型,并相当稳定。

(2)菌株对所测定抗菌药物的抑菌环直径或MIC值稳定一致。

(3)对测试项目反应敏感。如测试在巧克力琼脂平板的分离能力,应选择流感嗜血杆菌或脑膜炎奈瑟菌。

(二)临床菌株

根据临床检验、教学、科研的需要,从临床各类标本中分离的典型菌株或比较少见菌株,也可做短期或长期保存。

二、各类菌种的保藏方法

保存菌株所采用的培养基必须能使微生物长期维持生存与稳定,不出现生长或新陈代谢过于旺盛的情况,使菌株较长时间存活而保持性状稳定。

(一)培养基直接保存法

(1)将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上,待菌充分生长后,棉塞部分用油纸包扎好,移至4℃的冰箱中保藏。

(2)保藏时间依微生物的种类而有所不同,放线菌及有芽胞的细菌保存2~4个月移种一次。一般细菌每月移种一次。
此法为临床微生物实验室和教学实验室常用的保藏法,优点是操作简单,使用方便,不需特殊设备,能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是屡次传代易使微生物发生变异,表现为代谢等生物学性状的改变,且污染杂菌的机会亦较多。

(二)液体石蜡保藏法

(1)将液体石蜡分装于三角烧瓶内,塞上棉塞,并用牛皮纸包扎,1.05 kgf/cm2(1kgf/cm2=0.098 MPa),121.3 ℃高压蒸汽灭菌20 min,然后放在40℃温箱中,使水汽蒸发掉,备用。

(2)将需要保藏的菌种在最适宜的斜面培养基中培养,以得到健壮的菌体。

(3)用无菌吸管吸取灭菌的液体石蜡,注入已长好菌的斜面上,其用量以高出斜面顶端1 cm为准,使菌种与空气隔绝。

(4)将试管直立,置于低温或室温下保存(有的微生物在室温下比冰箱中保存的时间还要长)。

此法实用且效果好。放线菌、芽胞细菌可保藏2年以上,一般无芽胞细菌也可保藏1年左右,甚至用一般方法很难保藏的脑膜炎球菌,在37 ℃温箱内,亦可保藏3个月之久。其优点是制作简单,不需特殊设备,且不需经常转种。缺点是保存时必须直立放置,所占位置较大,同时也不便携带。从液体石蜡下面取培养物移种后,接种环在火焰上烧灼时,培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅,应特别注意。

(三)滤纸保藏法

(1)将滤纸剪成0.5 cm×1.2 cm的小条,装入0.6 cm×8 cm的安瓿管中,每管1~2张,塞以棉塞,1.05 kgf/cm2,121.3℃高压蒸汽灭菌20 min。

(2)将需要保存的菌种,在适宜的斜面培养基上培养,使其充分生长。

(3)取灭菌脱脂牛乳1~2 mL,滴加在灭菌平皿或试管内,取数环菌苔在牛乳内混匀,制成浓悬液。

(4)用灭菌镊子自安瓶管取滤纸条浸入菌悬液内,使其吸饱后再放回至安瓶管中,塞上棉塞。

(5)将安瓿管放入内有五氧化二磷作吸水剂的干燥器中,用真空泵抽气至干。

(6)将棉花塞入管内,用火焰熔封,保存于低温下。

(7)需要使用菌种进行复活培养时,可将安瓶管口在火焰上烧热,滴一滴冷水在烧热的部位,使玻璃破裂,再用镊子敲掉口端的玻璃,待安瓿管开启后,取出滤纸将其放入液体培养基内,置于温箱中培养。

细菌可保藏2年左右,此法较液氮、冷冻干燥法简便,不需要特殊设备。

(四)冷冻真空干燥保藏法

1.准备安瓿管用于冷冻干燥菌种保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造,形状可用长颈球形底,亦称泪滴型安瓿管,大小要求外径6~7.5 mm,长105 mm,球部直径9~11 mm,壁厚0. 6~1.2 mm。也可用没有球部的管状安瓿管。塞好棉塞,1.05 kgf/cm2,121.3 ℃高压蒸汽灭菌20 min,备用。

2.准备菌种用冷冻真空干燥法保藏的菌种,其保藏期可达数年至十余年,为了在许多年后不出差错,故所用菌种要特别注意其纯度,不能有杂菌污染,然后在最适培养基中以最适温度培养。菌龄要求超过对数生长期,若用对数生长期的菌种进行保藏,其存活率反而降低。一般要求24~48 h的培养物;放线菌则培养7~10天。

3.制备菌悬液与分装以细菌斜面为例,用脱脂牛乳2 ml,左右加入斜面试管中,制成浓菌液,每支安瓿管分装0.2 ml。

4.冷冻真空干燥 将分一袋好的安瓿管放入低温冰箱中冷冻,无低温冰箱可用冷冻剂如干冰(固体CO2)酒精液或干冰丙酮液。将安瓿管插入冷冻剂,只需冷冻4~5 min,悬液即可结冰。为在真空干燥时使样品保持冻结状态,需准备冷冻槽,槽内放碎冰块与食盐,混合均匀,可冷至-15℃。抽气一般若在30 min内能达到93.3Pa(0.7 mmHg)真空度时,则干燥物不致熔化,继续抽气至肉眼观察被干燥物已趋千燥,一般抽到真空度26.7Pa(0.2 mmHg),保持压力6~8 h即可。

5.封口真空干燥后取出安瓿管,接在封口用的玻璃管上,用L形五通管继续抽气,约10 min即可达到26.7 Pa。于真空状态下以煤气或酒精喷灯的细火焰在安瓿管颈中央进行封口。封口后保存于冰箱或室温暗处。

三、菌种保藏机构

目前,国内外有一些专门机构进行菌种保藏和供应。如:美国典型菌种保藏中心(ATCC)、英国国家典型菌种保藏中心(NCTC)、德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)、法国巴斯德研究所菌种保藏中心(CIP)、荷兰微生物菌种保藏中心(CBS)、新西兰环境科学研究所医学部微生物保藏中心(ESR)、中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)、中国医学细菌保藏管理中心(NMCC(B))、中国抗生素菌种保藏管理中心(CACC)、中国典型培养物保藏中心(CCTCC)等。

四、菌种保存的注意事项

1.入库菌种应建立档案菌种档案应包括菌种名称、编号、来源、保存日期、传代日期、定期鉴定的生化反应结果等,并详细记录菌种档案年限、菌种种类,分别归档管理,每一菌种一页,记录传代和复查结果。

2.菌种实行双人双管保存菌种的冰箱应上锁,实验室保存的菌株不得擅自处理或带出实验室,如确因工作或科研需要而带离实验室,须经上级有关领导批准,并做好详细记录。

3。实验室保存菌种应按规定时间转种每转种三代做一次鉴定,检查该菌株是否发生变异,并在菌种档案卡上做详细记录,包括菌名、来源、标号、保存转种日期、菌株是否发生变异等。如遇工作调动,应及时做好交接工作。

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