一、实验目的

    掌握采用LC-MS联用方法检测蜂蜜中磺胺醋酰、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲异嗯唑、磺胺氯哒嗪、磺胺嘧啶、磺胺甲基异唾唑、磺胺噻唑、磺胺一6甲氧嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺吡啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺二甲嘧啶、磺胺苯吡唑、磺胺间二甲氧嘧啶等16种磺胺类抗生素残留量的原理与方法。

   二、实验原理

   蜂蜜中磺胺类药物残留经磷酸溶液提取，阳离子交换柱和固相萃取柱净化，浓缩蒸于后，以乙腈一NH₄Ac溶液溶解，用LC-MS仪测定，外标法定量。

   三、仪器与试材    

   1．仪器与器材

   LC-MS仪(配有电喷雾离子源)、固相萃取真空装置、旋转蒸发器、液体混匀器、pH计等。

   2．试剂

   除特别注明外，实验中所用试剂均为分析纯，水为去离子水或蒸馏水。

   (1)常规试剂：甲醇、乙腈、H₃P0₄、庚烷磺酸钠、NH₄Ac、KH₂PO₄、K₂HPO₄。

   (2)磺胺类抗生素标准品：磺胺醋酰、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲异嗯唑、磺胺氯哒嗪、磺胺嘧啶、磺胺甲基异嗯唑、磺胺噻唑、磺胺一6一甲氧嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺吡啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺二甲嘧啶、磺胺苯吡唑、磺胺间二甲氧嘧啶，共16种，纯度均≥99％。

    (3)常规溶液：H₃PO₄溶液(O．1％，pH=2)、磷酸缓冲溶液(O．2mol／L，pH=8)、庚烷磺酸钠溶液(O．5mol／L)、乙腈-O.01mol／L NH₄Ac溶液(12+88，体积比，洗脱液)。

    (4)净化柱：苯磺酸型阳离子交换柱(500mg，3mL)、C18固相萃取柱(5OOmg，3mL)。

    (5)16种磺胺标准储备溶液(O．1 mg／mL)：称取适量的每种磺胺标准品物质，用甲醇配成标准储备溶液，于4℃保存，可使用两个月。

    (6)磺胺混合标准工作溶液：根据每种磺胺的灵敏度和仪器线性范围，用空白样品提取液配成不同浓度(ng／mL)的混合标准工作溶液，于4℃保存，可使用1周。

    3．实验材料

    2～3种蜂蜜，各250g。

    四、实验步骤

    1.样品处理

    (1)对有结晶的蜂蜜样品，在密闭情况下，置于不超过60℃的水浴中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，迅速冷却至室温备用；对无结晶蜂蜜样品，将其搅拌均匀备用。

    (2)称取5．00g搅拌均匀的样品，置于150mL锥形瓶中。加入25mL H₃PO₄溶液，在液体混匀器上高速混合5min，使试样完全溶解。

    2．样品净化

    (1)将苯磺酸型阳离子交换柱先用5mI．甲醇和10mL水预洗并保持柱体湿润。

    (2)在减压情况下，使样品液以小于等于3mL／min的流速通过苯磺酸型阳离子交换柱，待

样液完全流出后，分别用5mL H₃PO₄溶液和5mL水洗柱，弃全部流出液。

    (3)以40mL磷酸缓冲溶液洗脱，收集洗脱液于100mL平底烧瓶中，加1．5mL庚烷磺酸钠溶液，以H₃PO₄调pH至6。

    (4)将C18固相萃取柱净化，用5mL甲醇和10mL水预洗并保持柱体湿润，备用。

    (5)将(3)的洗脱液过C18固相萃取柱，调节流速小于等于3mL／min，待洗脱液完全流出后，用3mL水洗柱，弃全部流出液。

    (6)在65kPa的负压下减压抽干5min，以10mL甲醇洗脱，收集洗脱液，于旋转蒸发器上于45℃减压蒸发至干。以1.0mL乙腈-0.01mol／L NH。Ac流动相溶解残渣，供液相色谱一质谱联用仪测定用。

    3.测定

    (1)将鼢标准工作溶液进样于LC—MS仪进行测定，以工作溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。

    (2)同时，对样品净化液进行分析，根据保留时间定性，以峰面积定量。

    (3)参考色谱条件：色谱柱为Lichrospher R100RP-18柱(250mm×4．6mm，5μm)；流动相为乙腈一0．01mol／L NHtAc溶液，流速为O．8mL／min；柱温为35℃；进样量为40μL；分流比为1：3。

    (4)参考质谱条件：电喷雾离子源；正离子扫描；多反应监测；电喷雾电压为5500V；雾化气压力为O．076MPa；气帘气压力为0．069MPa；辅助气流速为6L／min；离子源温度350℃；去簇电压为55V。

    (5)在上述条件下，制定16种磺胺的保留时间表，定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压表。

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┃    药物名称      ┃    保留时间／min ┃    药物名称      ┃  保留时间／min ┃

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┃  磺胺醋酰        ┃    2．61         ┃磺胺甲基嘧啶      ┃    9．93       ┃

┃  磺胺甲噻二唑    ┃    4．54         ┃磺胺邻二甲氧嘧啶  ┃    11．29      ┃

┃  磺胺二甲异嗯唑  ┃    4．91         ┃磺胺吡啶          ┃    11．62      ┃

┃  磺胺氯哒嗪      ┃    5．20         ┃磺胺对甲氧嘧啶    ┃    12．66      ┃

┃  磺胺嘧啶        ┃    6．54         ┃磺胺甲氧哒嗪      ┃    1 Z．28     ┃

┃                  ┃    ‘            ┃                  ┃                ┃

┃  磺胺甲基异嗯唑  ┃    8．41         ┃磺胺二甲嘧啶      ┃    17．95      ┃

┃  磺胺噻唑        ┃    9．13         ┃磺胺苯吡唑        ┃    22．29      ┃

┃  磺胺6甲氧嘧啶   ┃    9．48         ┃磺胺问二甲氧嘧啶  ┃    28．97      ┃

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    (6)平行试验与空白试验(除不称取试样外，均按上述步骤进行)。

    4．计算

    按下式计算待测试样中磺胺类抗生素的残留量(计算结果应扣除空白值)：

    x_i=c_iV/m

    式中，x_i为样品中j种磺胺的残留量，μg／kg；c_i为样品净化液中i种．磺胺的浓度，ng／mL；V为样品液的定容体积，mL；m为样品净化液代表的样品质量，g。

    五、注意事项

    实验步骤中的色谱条件和质谱条件仅供参考，在实际分析中，应根据仪器的型号和实验条

件，依据说明书，通过预备实验确定。

    六、思考题

    1．简述在LC—MS中样品净化的必要性。

2．什么叫定性离子对、定量离子对?它们是如何产生的?