一、实验目的

    二、实验原理

    样品中氯霉素以乙酸乙酯提取，提取液经浓缩后，以水溶解，Oasis HLB固相萃取柱净化，然后以LC—MS仪测定，根据保留时间定性，外标法定量。

    三、仪器与试材

    1．仪器与器材

    液相色谱一串联四级杆质谱仪(配有电喷雾离子源)、液体混匀器、固相萃取真空装置、自动

浓缩仪、氮气吹干仪、振荡器、组织匀浆器、离心机等。

    2．试剂

    除特别说明外，实验中所用试剂均为分析纯，水为去离子水或蒸馏水。

    (1)常规试剂与溶液：乙酸乙酯、甲醇、乙腈、乙腈一水溶液(1+7、1+4，体积比)。

    (2)Oasis HLB固相萃取柱(60mg，3mL)：使用前分别用3mL甲醇和5mL水预处理，保

持柱体湿润。

    (3)氯霉素标准储备溶液(0.1mg／mL)：称取适量的氯霉素标准物质(纯度≥99％)，以甲醇配制，于4℃储存，可使用两个月。

    (4)氯霉素标准工作溶液：用空白样品提取液将氯霉素标准储备溶液分别配成氯霉素浓度为0.5ng／mL、1.0ng／mL、5.0ng／mL、10ng／mL、50ng／mL和100ng／mL的标准工作溶液，于4℃保存，可使用l周。

    3．实验材料    

    2～3种鳗鱼，各250g。

    四、实验步骤

    1．样品提取

    (1)将100g鳗鱼样品去皮、去骨，切碎后匀浆，置于—20℃保存。

    (2)取5.00g匀浆样品于50mL聚丙烯具塞离心管中，加入5mL水，于液体混匀器上快速

混合lmin。准确加入15mL乙酸乙酯，在振荡器上振荡10min后，以3000r／min离心5min，吸取上层乙酸乙酯12mL转入自动浓缩仪的蒸发管中，用自动浓缩仪在55℃减压蒸干后，以5mL水溶解残渣，用于净化。

    2．样品净化    

    (1)样品提取液以小于等于3mL／min的流速通过Oasis HLB固相萃取柱，待溶液完全流出后，用10mL水分两次洗蒸发管和储液器并过柱，再用5mL乙腈一水溶液(1+7，体积比)洗柱，弃去全部淋出液，在65kPa的负压下减压抽干5min。

    (2)以5mL乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液于10mL刻度离心管中。于50℃用氮气吹干仪吹干，用乙腈一水溶液(1+4，体积比)定容至0．8mL，供液相色谱一串联质谱仪测定用。

    3．测定

    (1)将氯霉素标准溶液在LC-MS联用仪上分析，以溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，

绘制标准工作曲线。    

    (2)同时，对样品净化液进行分析，并根据标准曲线查出样品净化液中氯霉素残留的浓度。

    (3)参考色谱条件：色谱柱为PinnacleⅡC18柱(150mm×2.1mm，5μm)；流动相为乙腈水溶液(1+4，体积比)，流速为0．2mL／min；柱温为30℃；进样量为40μL。

    (4)参考质谱条件：电喷雾离子源；负离子扫描；多反应监测；电喷雾电压为4500V；雾化气压力为0.069MPa；气帘气压力为0.069MPa；辅助气流速为6L／min；离子源温度为450℃；去簇电压为、55V。

    (5)平行试验和空白试验(除不称取试样外，均按上述步骤进行)。

    4．计算

    按下式计算样品中氯霉素的残留量：    

    x=cV/m

    式中，x为样品中氯霉素的残留量，μg／kg；c为样品净化液中氯霉素的浓度，ng／mL．；V为样品净化液的定容体积，mL；m为净化液代表样品的质量，g。

    五、注意事项

    1．计算结果应扣除空白值。

    2．在用标准曲线对样品进行定量时，样品溶液中氯霉素的响应值均应在仪器测定的线性范围内，否则应对样品溶液进行稀释或浓缩。

    3．实验步骤中的色谱与质谱条件仅供参考，实际分析过程中应根据仪器的型号和实验条件，依据说明书，通过预备实验进行调整。

    4．在本实验的参考色谱条件下，氯霉素的保留时间为12.31min。

    六、思考题

    1．简述采用HPLC与LC—MS测定抗生素的异同。

    2．简述质谱分析中定性离子对和定量离子对的含义，并说明它们是如何产生的。