一、实验目的    

    掌握以薄层色谱法测定粮食中六六六和DDT残留量的原理和方法。

    二、实验原理

    粮食中六六六和DDT残留经有机溶剂提取，并经H2SO4处理，除去干扰物质，浓缩，点样展开后，用AgNO₃显色，经紫外线照射后生成棕黑色斑点，斑点颜色的深浅与六六六和DDT残留量成比例关系。通过与标准品比较可实现定性定量分析。

    三、仪器与试材

    1．仪器与器材

    粉碎机、振荡器、旋转蒸发器、离心机、薄层板涂布器、玻璃板、展开槽、玻璃喷雾器、紫外灯、微量注射器等。

    2．试剂

    除特别说明，实验中所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水或去离子水。

    (1)常规试剂：苯氧乙醇、H₂O₂(30％)、苯、NaCl、丙酮、正己烷、石油醚(沸程30～60℃)、浓H₂SO₄、无水Na₂SO₄、氧化铝G(薄层色谱用)。

    (2)农药标准品：六六六(α-BHC、β-BHC、γ-BHC和δ-BHC，纯度>99％)；DDT(p,p'-DDE、o,p’-DDT、p,p’-DDD和p,p’-DDT，纯度>99％)。

    (3)常规溶液：Na₂SO₄溶液(20g／L)、AgNO3溶液(10g／L)、丙酮一己烷混合液(1+99，体积比)。

    (4)AgNO₃显色液：将0.050g AgNO₃溶于数滴水中，加10 mL苯氧乙醇与10μL H₂O₂，混合后储于棕色瓶中，4℃保存。

    (5)六六六和DDT标准储备液(100μg／L)：精密称取α—BHC、 β—BHC、γ—BHC、δ—BHC、p,p’一DDE、o,p’一DDT、p,p’一DDD、p,p’一DDT各10mg，溶于苯中，分别移人100mL容量瓶中，以苯稀释至刻度，混匀，4℃保存。

    (6)六六六和DDT标准工作液(20μg／mL)：各吸取六六六和DDT标准溶液2．0mL，分别移入10mL，容量瓶中，各加苯至刻度，混匀。

    3．实验材料

    2～3种稻谷、小麦、玉米，各250g。    

    四、实验步骤

    1．样品提取

    (1)将100g稻谷、小麦和玉米样品分别粉碎，过40目筛。

    (2)称取20．00g粉碎样品于150mI．锥形瓶中，加20mL水、40mL丙酮，振荡30min后，加6g NaCl，溶解摇匀后，加30mL石油醚，再振荡30min，静置分层。

    (3)取10mL上层石油醚清液于15mL离心管中，在通风橱中挥发浓缩至1mL后，加0.1mL浓H₂SO₄，盖上塞子振摇数次，打开塞子放气后，再振摇0.5min。

    (4)以1600r／min离心15min，上清液供薄层色谱分析。

    2．薄层板的制备

    (1)称取4．5g氧化铝G，加1mL AgNO₃溶液及6mL水，研磨至糊状。

    (2)立即均匀涂布于三块薄层板上，涂层厚度为0.25mm。

    (3)于100℃烘干0.5h，置于干燥器中，避光保存。

    3．薄层色谱分析

    (1)点样：离薄层板一端(底端)2cm处，用铅笔轻轻划标记线。在标记线上点10μL试样液和一定体积的六六六或DDT标准工作液，使标准液点的农药量分别为0.02／2g、0.04μg、0.06μg、0.08μg。中间4点为标准溶液，两边各点两个样液点，点与点之间距离不小于1cm。

    (2)展开：在展开槽中预先加入20mL左右的丙酮己烷}昆合液。将点样薄层板放入槽内展开。当溶剂前沿距离点样原点10cm时取出，自然挥干。

    (3)显色：将挥干后的薄层板置于通风橱中，将10mLAgNO₃显色液均匀喷于薄板上，干燥后距紫外灯(40W)8cm处照10cm，六六六和DDT等全部显现棕黑色斑点。分别测量六六六、DDT各异构体斑点的移动距离及溶剂前沿的移动距离，计算R_f值。

    (4)定性分析：对照比较样液斑点与标准斑点的R，值，对六六六、DDT等各个异构体进行定性分析。

    4．计算

    采用目测比较法进行定量，即日测样品斑点的颜色深浅，与相应的标准农药异构体斑点相比较，找出与样品斑点颜色最接近的标准斑点，并以此标准斑点农药量作为点样样液中相应农药异构体的含量。用下式计算样品中六六六、DDT各个异构体的含量：

               x=(m₁V×1000)/mV1

    式中，x为样品中六六六、DDT某异构体的含量，mg／kg；m1为样品提取液中六六六、DDT某异构体的质量，μg；V₁为点样体积，μL；V为样品浓缩液的总体积，mL；m为样品的质量，g。

    最后，将六六六、DDT的不同异构体的单一含量相加，即得出样品中六六六、DDT的总残留量。

    五、注意事项

    1．在空气湿度较高的情况下(相对湿度在75％以上)，点样须在干燥槽中进行，避免薄层板吸收水分，影响分离效果。

    2．标准液的点样量可适当增减，使之与样品中的含量相近，以便于比较。

    3．本实验测定结果仅为半定量，如果使用薄层色谱扫描仪可实现定量分析。

    六、思考题

    1．叙述AgNO₃与六六六和DDT显色的机理。

    2．叙述在样品处理过程中加入：NaCl的作用。

    3．简述薄层色谱法测定有机氯农药残留的优缺点。

    4．根据R_f从大到小的顺序，将p,p’一DDE、o,p’一DDT、p,p’一DDT、α—BHC、p,p’一DDD、γ—BHC、β—BHC、δ—BHC进行排列。