肝脏是生理和病理状态下能量代谢、毒素的生物转化以及血浆蛋白合成的中心器官，是机体最重要的器官之一。肝损伤是由各种肝脏疾病所产生的病变结果。临床上造成急性肝损伤的原因有病毒感染、药物毒性、乙醇、食物中毒、缺血缺氧、放射性损伤等。培养体系中的肝细胞可以很好地模拟体内肝脏生理环境，作为研究肝特异代谢过程和肝脏功能的重要工具。通过建立实验性急性肝细胞损伤模型，可以直接观察药物的保肝作用，进行保肝药物的筛选，并探讨药物的保肝作用机制。

［原理和目的］

肝细胞培养分为原代培养和传代培养。绝大多数原代肝细胞培养在大鼠中进行。分离原代肝细胞的方法有机械分离法、胶原酶分离法、胰蛋白酶消化法、含鳌合剂的无钙离子溶液灌注法、酸性磷酸盐灌注法等，其中两步胶原酶灌注是原代肝细胞分离的经典方法。原代肝细胞的培养较难，且一般只能传至10代左右，细胞即停滞生长，大部分衰老死亡，只有少数细胞能存活到40～50代。传代的肝细胞培养简单且可多次传代，易于实验，实验中也可用传代的肝细胞代替原代肝细胞，常用的传代肝细胞有HepG2和L02等，其中L02更贴近于体内肝细胞的特性而常用于实验研究。

将分离的原代肝细胞或传代肝细胞置于适宜的培养液中进行培养，以肝细胞损伤剂造成细胞损伤。损伤剂可用四氯化碳（CCL4) ,D-氨基半乳糖（D-GL)、对乙酰氨基酚(APAP),硫代乙酰胺（TAA)、对醋氨酚（AAP)、缺氧／复氧( hypoxia-reoxygenation, H/R）等。肝脏缺血再灌注是急性肝损伤的一种，利用体外培养肝细胞缺氧／复氧模型，模拟在体肝脏缺血／再灌注损伤，既可使肝细胞不受邻近细胞相互作用和生理反馈机制等因素的影响，又可直接观察到抗急性肝损伤药物对肝细胞的作用。下文以该模型为例介绍抗急性肝损伤药物对培养细胞的影响。

【材料】

1．雄性SD大鼠，体重250～300g。

2．试剂

（1）培养基（RPMI 1640)、胎牛血清等；

(2）消化液：胰蛋白酶、EDTA, N型胶原酶；

(3）缓冲液：Hanks液，D-Hanks液（每l000ml含NaCl 8.00g, KCl 0.40g, Na₂HPO₄·12H₂0 0.06g,NaHCO₃ 0.35g,KH₂P0₄ 0.06g) ,PBS（每l000ml含NaCl 8g, KC1 0.2g,Na₂HPO₄ 1.44g,KH₂P0₄ 0.24g)。

(4) 10％水合氯醛，MTT，超氧化物歧化酶(SOD）试剂盒，二甲亚砜(DMSO)。

3．仪器 净化工作台、三气恒温孵箱、倒置显微镜、离心机、分光光度计、酶标仪、流式细胞仪。

【方法】

1．肝细胞缺氧培养以大鼠肝细胞两步灌流法分离原代肝细胞（及传代肝细胞）正常培养和缺氧培养为例的方法介绍如下。实验操作应完全在无菌条件下进行。细胞正常体外培养在5% C0₂与95％空气环境中，可通过降低培养环境的氧分压或使细胞用氧障碍造成缺氧。缺氧模型有物理性缺氧和化学性缺氧两种，用于制作低氧模型最理想的装置是三气培养箱。在此以物理缺氧的三气培养箱为例介绍肝细胞的缺氧培养。

(1)大鼠肝细胞的原代培养：制备体外原代肝细胞常用的方法有：非酶分离细胞法、离体肝脏酶消化分离法、在体肝脏酶灌注法等。这些分离方法可以相互补充，灵活应用。下面以在体肝脏酶灌注法为例制备原代肝细胞，按照Seglen的两步灌流法分离肝细胞制备肝细胞悬液：用10％水合氯醛腹腔注射麻醉SD大鼠后将其固定在手术板上，常规消毒后打开腹腔，用静脉输液管行门静脉插管，灌入37℃的D-Hanks液（30m1/min )，同时剪断下腔静脉放血。灌流约5分钟后，待肝脏颜色完全变为土黄色后，改用37℃含0.05%Ⅳ型胶原酶的Hanks液继续灌流（10ml/min )，约15分钟后，压之凹陷不易恢复，迅速取下肝脏，剔除肝包膜，并不断抖动以抖落肝细胞，让细胞游离出来，200目滤网过滤。滤液600r/min离心2分钟，弃上清液，重复2次。将沉淀细胞悬浮于RPMI 1640培养液中接种于25 ml培养瓶，常规培养（37℃,5% C0₂,95% 02) 24～36小时后换入新鲜培养液。

(2）传代肝细胞的培养：因L02细胞在实验中较为常用，故以L02细胞为例介绍传代细胞的培养方法。L02为人正常肝细胞，生长在含1 mmol/L谷氨酰胺、1ug/ml葡萄糖0.22u/ml胰岛素和10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中。

(3)肝细胞的缺氧／复氧培养：将肝细胞按1x10⁶/ml分别接种于96孔和24孔培养板中，每组6孔，常规培养12小时。建立缺氧复氧的模型：缺氧培养（将细胞放入37℃,95% N₂,5% C0₂培养箱中培养4小时），复氧培养（将细胞放入37℃,5% C0₂,95％空气培养箱中培养10小时）。

2．实验设计通常把细胞分成正常组、缺氧／复氧组（肝细胞进行缺氧4小时，复氧10小时处理）、若干给药组（缺氧／复氧，加不同剂量抗肝损伤药物）。给药组细胞在缺氧前两个小时给予不同剂量的药物处理。通过细胞形态学观察，MTT法检测细胞存活率，流式细胞仪检测细胞凋亡以及检测SOD的活性，从而研究抗急性肝损伤药物对缺氧复氧肝细胞的保护作用。

【结果与分析】

1．细胞形态观察正常生长的肝细胞呈三角形、方形或类圆形，排列整齐，细胞界限清晰，细胞质为颗粒状，丰富透亮。细胞核有单核、双核。部分细胞呈多边形展开，有些细胞开始呈岛状连接。损伤组如缺氧复氧（H/R）的肝细胞超微结构改变，细胞膜出现损伤，线粒体重度肿胀，内膜破裂，线粒体嵴明显减少或消失，出现气球样变，肝细胞的细胞核固缩，核内染色体消失。给药组的细胞，细胞膜及各种细胞器的膜结构比较完整，线粒体排列比较正常，无明显肿胀。

2. MTT法测定细胞存活率缺氧复氧结束后去掉96孔板中培养液，每孔加入5g/L的MTT液20ul，继续常规培养4小时，每孔加入DMSO 180ul，振荡后用酶标仪于波长570nm测定每孔的吸光度（OD）值，每组实验至少重复3次。

计算细胞存活率：

细胞存活率A值=（实验组OD值-空白对照OD值）／（正常组OD均值-空白对照OD值）x100%

3．细胞凋亡的检测缺氧复氧的条件下，肝细胞会发生明显的凋亡。

(1)细胞收集：从培养箱中取出复氧后的细胞，吸去培养液上清液，2m1 PBS清洗两遍。

(2）每瓶中加入含0.02% EDTA的0.25%胰酶0.5ml,37℃消化3分钟，倒置显微镜下见细胞变圆，细胞间隙变大时，加入2ml培养基终止消化。1000r/min离心5分钟，弃上清液。

(3)加入100ul 1倍的结合缓冲液（由20倍结合缓冲液制备），制备细胞悬液。

(4）向细胞悬液中加入10ul AnnexinV-FITC和5 u1碘化丙啶(PI)，混合均匀。

(5）室温避光孵育15分钟（提示：在冰浴上操作将增加孵育时间，较高温度或较长时间的孵育将引起细胞的非特异性标记）。

(6)加入1倍结合缓冲液400 u1，充分混匀。

(7）流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长用488nm，用一波长为515nm的通带滤器(band pass filter）检测FITC荧光，另一波长大于560nm的滤器检测PI。

4．肝细胞内SOD活性的检测收集24孔板的细胞，经1500r/min离心3分钟后，弃去上清液，将剩下的肝细胞加入细胞裂解液混匀，12 OOOr/min离心10分钟，取上清液按照SOD试剂盒的说明书测定肝细胞内SOD活性。随损伤加重，SOD活性下降。

【注意事项】

1．缺氧培养对氧气的含量要求严格，在实验造模的过程中，要严格控制氧含量，保证缺氧环境。

2．细胞在体外培养时其形态、性能和体内均有差别，因此，体外模型实验结果应结合活体实验结果进行客观分析，合理解释。

3．无菌操作是细胞培养成功的必备条件。细胞在培养的过程必须保证无微生物污染和不受其他有毒、有害因素的影响。

4．要找到最适灌流速度和压力，若灌流速度和压力不够，胶原酶无法充满整个肝脏导致消化不全；反之，流速太快、压力太大则会增加对肝细胞的机械性损伤，以上这两种情况均会导致分离的肝细胞活力的低下。