一、癌基因及抑癌基因检测

癌基因（oncogen）和抑癌基因（tumorsuppressorgene）是直接参与肿瘤发生、发展的两大基因。现已知道，癌基因有一百多种，而抑癌基因却不多。在众多的癌基因中，任何一种（或多种）被激活均可能引发细胞癌变。癌基因的表达产物，也会促进细胞过分增殖，具有潜在诱导细胞恶性转化的作用。抑癌基因正常表达的产物对肿瘤的增殖起着抑制作用，具有调节细胞正常增殖和分化的功能。癌基因的激活及抑癌基因的失活是导致细胞增殖、分化、凋亡失控而发生癌变的重要原因。

癌基因是在自然或试验条件下，细胞和病毒中存在的能诱导正常细胞恶性转化的潜在活性基因。在病毒中存在的癌基因称为病毒癌基因（virus oncogen, V-Onc) ;脊椎动物正常细胞中存在的具有与病毒癌基因相似的同源DNA序列，突变后使细胞增殖、分化、凋亡产生异常变异，成为细胞癌基因（cell oncogen, C-Onc）或原癌基因。人类肿瘤常见的原癌基因有：sre癌基因，与乳腺癌、骨肉瘤、神经母细胞瘤有关；ras 癌基因，与骨髓增殖异常综合征和急性白血病、肺肿瘤发生有关；k-ras癌基因与膀胱癌发生相关myc癌基因与大肠癌、胃癌、神经母细胞瘤、网膜母细胞瘤、白血病、小细胞肺癌及Wilms瘤发生有关，myc产物的抗体在肿瘤免疫诊断中很有意义；c-erbB-2癌基因与卵巢癌、乳腺癌的发生有关。

抑癌基因是存在于正常细胞中抑制细胞恶性增殖的基因。这些基因通过编码一些具有转录因子作用的蛋白质，从多个调控点参加对细胞增殖、分化和凋亡的调节，其缺失和失活将导致细胞恶变。目前发现最有意义的抑癌基因为Rb基因和P53基因。

癌基因在正常人群表达不明显或不表达。在恶性肿瘤患者中，其肿瘤细胞的分泌产物中可有癌基因表达产物的过表达，也可以表现为抑癌基因表达产物的缺失或抑癌基因突变产物的过表达。

癌基因和抑癌基因及其表达产物，可以通过放射免疫分析方法、化学发光免疫分析方法、电化学发光免疫分析方法以及免疫细胞化学技术、流式细胞术、PCR技术和基因诊断技术等方法进行检测。下面仅就常用的两种检测方法作以介绍。

（一）聚合酶链式反应一单链构象多态性分析法（PCR-SSCP )

单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种结构依赖于碱基组成，即使是一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构并引起在非变性电泳条件不同的电泳迁移率。也就是说，单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，其泳动速度不完全依赖分子量的大小，而主要与其二级空间构象有关，DNA片段中个别碱基发生变化，将会引起单链DNA二级结构的变化，在聚丙烯酰胺凝胶上出现异常移动条带。

优点：由于PCR一单链构象多态性分析法（single strand conformation polymophism,SSCP)技术不需要使用限制性内切酶和探针，也不涉及核酸杂交过程，故方法简便、快速，且敏感性强。有碱基插入时，将会出现异常条带，在电泳结果上直接可见。PCR-SSCP有以下三种基本方法：

1．银染方法检测基因突变本实验以P53抑癌基因为例，介绍银染PCR-SSCP反应检测P53抑癌基因突变的方法。

【材料】

（1）DNA提取材料：液氮、0.05mmol/L Tris·Cl(pH 8.0)（TBS,50ml 0.1mmol/L Tris与29.2ml 0.1mol/L HCl混合，加水将体积调至100ml),TE(pH 8.0)、抽提缓冲液（10mmol/L Tris·Cl (pH 8.0),0.1mol/L EDTA(pH 8.0),2ug/ml胰RNA酶,0.5% SDS、蛋白酶K,酚、10mol/L醋酸铵,70％乙醇。

(2) PCR反应材料：10xPCR缓冲液、dNTP、引物P₁和P₂,MgC1₂,Tris·Cl(pH 8.3),KC1,Taq DNA多聚酶,2％琼脂糖凝胶。

(3) SSCP分析材料：0.5mol/L NaOH,10mmol/L EDTA、含50m1/L甘油的100ml/L聚丙烯酰胺凝胶、0.5xTBE电泳缓冲液、含100ml/L甘油的100ml/L聚丙烯酰胺凝胶和1xTBE电泳缓冲液、10％乙醇、10ml/L HN0₂,2g/L AgN0₃,62.5g/L Na₂C0₃、冰醋酸、甲醛、醋酸。

【方法】

（1)收集标本

(2) DNA提取

1)将刚切制的组织块置于盛有液氮的研钵中，快速搅切至组织粉碎成粉末。待液氮蒸发，将组织粉末小心地移入近10倍体积的抽提缓冲液中，尽可能使其完全分散于溶液中。

2）将上述溶液转移至50m1离心管，37℃温育1小时。

3）用玻璃棒温和地将蛋白酶K（终浓度100 ug/ml )混入a稠的溶液中。

4）将裂解细胞的悬液置于50℃水浴中3小时，经常旋动离心管。

5)将溶液冷却至室温，加等体积经0.5mmol/L Tris·Cl(pH 8.0)平衡的酚，缓慢轻柔地颠倒离心管10分钟，小心地混合两相。

6)用大口径移液管（出口直径0.3cm，必要时可将移液管头端剪断）将黏稠的水相转移至另一干净的离心管中。用平衡酚重复抽提2次。

7）将第三次抽提后的全部水相移至另一干净离心管中，于室温加入0.2倍体积的l0mol/L醋酸铵和2倍体积的70％乙醇，使溶液充分混合，DNA立即形成沉淀。尽可能彻底地去除70％乙醇，于室温使残留的乙醇挥发干净。注意不要使DNA沉淀完全干燥，否则DNA极难溶解。

8) DNA的分析和定量：测定260nm和280nm处的光吸收，A260/A280应大于1.75。按1OD₂₆₀=50ug/ml DNA计算DNA浓度。DNA于4℃贮存。

(3)聚合酶链反应（PCR)：用50ul反应体系

10xPCR缓冲液    5 u1

dNTP     0.2mmol/L

引物     上下游引物各25pmol

MgCl₂    1.5 mmol/L

Tris·Cl(pH 8.3）    10mmol/L

KCl    50mmol/L

Taq DNA多聚酶    2U

模板DNA     0.5 ug

加水至50ul，在PCR合成仪上进行：94℃预变性5分钟，

94℃    60s

55℃     45s

72℃     45s

循环30次后，72℃延伸5分钟，4℃终止反应。取5ul在2％琼脂糖凝胶上检测扩增结果。置于-20℃保存。

(4) SSCP分析

1）取PCR产物10u1，加0.5mol/L NaOH；10mmol/L EDTA各2 u1；

2) 42℃变性，10分钟；

3）加2ul上样缓冲液，电泳。电泳条件因扩增产物不同而略有不同。

第5,7外显子：含50ml/L甘油的100ml/L聚丙烯酰胺凝胶和0.5xTBE电泳缓冲液 第6外显子：含100m1/L甘油的100m1/L聚丙烯酰胺凝胶和1xTBE电泳缓冲液置于4℃,300V恒定电压持续电泳3小时左右。

(5)硝酸银染色

1)小心取出聚丙烯酰胺凝胶，10％乙醇，0.5％冰醋酸，固定15分钟，水冲洗2次。

2) 10ml/L HN0₂振荡5分钟，水冲洗2次。

3) 2g/L AgN03,1 ml/L甲醛溶液染色30分钟，水冲洗2次。

4) 62.5g/L Na₂C0₃,0.5ml/L甲醛溶液显色5～10分钟，水冲洗。

5) 100ml/L醋酸终止反应，无水乙醇脱水5分钟。

6)取出凝胶放到透明玻璃纸上，在白色或日光灯背景下显示棕黑色条带。

7）照相或干胶后长期保存，供单链构象多态性分析。

【结果与分析】

所用P53基因的3对引物在正常组织中的扩增产物均为密度一致的两条带，如果出现与正常对照组织不同的单链泳动变位或额外带即为突变。

【注意事项】

在PCR反应中注意反应条件的优化。

2. EB染色法检测基因突变以抑癌基因P16为例，介绍PCR-SSCP一染色检测基因突变的方法。

【材料】

（1) DNA提取材料及PCR反应材料：同基本方法1。

(2) SSCP分析材料：95％甲酰胺、20mmol/L EDTA,0.05%溴酚蓝、0.05％二甲苯氰(FF) ,8％聚丙烯酰胺凝胶、0.5%溴乙锭（EB)。

【方法】

（1)标本收集

(2) DNA提取：同基本方法1。

(3) PCR反应基本同基本方法1。由于引物的不同，在进行PCR反应时注意优化反应条件。需要通过预试验，决定反应条件。

(4) SSCP分析及EB染色：

取10ul经电泳证实为特异性扩增的PCR产物加入等量缓冲液：

95％    甲酰胺

20mmol/L     EDTA

0.05%    溴酚蓝

0.05％    二甲苯氰(xylene cyanole FF )

煮沸10分钟，速置冰浴中，大于5分钟，于8%聚丙烯酰胺凝胶上电泳，电压74V，电泳时间160分钟。

电泳完毕取下凝胶放入0.5%溴乙锭（EB）溶液中室温染色30分钟，紫外线灯下观察结果，照相。

【结果与分析】

当肿瘤组织与相应的正常组织比较带形迁移率发生改变时，为P16基因突变阳性。

【注意事项】

在PCR反应中注意反应条件的优化。

3．不对称PCR-SSCP检测基因突变

【材料】

同上述基本方法2。

【方法】

（1)标本收集

(2) DNA提取：同基本方法1。

(3) PCR反应同基本方法1。

(4）不对称PCR：第一次PCR扩增产物经3％的琼脂糖凝胶电泳30分钟后，纯化DNA，纯化后产物做不对称PCR的模板，分别取2ul产物加入Mixl和Mix2中再次扩增(Mixl中引物F, R的量分别为1 pmol及50pmol, Mix2中正好相反，其余扩增条件同第一次

PCR )；重复30个循环（引物P1、P2序列参见基本方法1)。

(5) SSCP分析及EB染色：（同基本方法2)

【结果与分析】

不对称PCR-SSCP方法与传统PCR-SSCP方法相比优势在于：不对称PCR-SSCP方法经凝胶电泳，至少可以显示三条带（包括一条单链DNA，一条互补单链DNA和双链DNA),在野生型和突变型同时存在的标本中会出现五条带；而传统的PCR-SSCP方法，其扩增产物电泳时只出现二条带（双链DNA和其中一条单链DNA)，即使在野生型和突变型同时存在的标本中，也只会出现三条带（双链DNA，突变型单链DNA和野生型单链DNA)，克服了传统方法中双链DNA不完全变性或非特异扩增的解读困难和错误判读，而且应用一对引物中不同当量的2个引物配成的反应混合物Mixl和Mix2，对标本同时进行两次检验，可以两次判定结果，进一步增加了实验的可靠性。