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影响肿瘤细胞生长实验

发布时间:2017-03-09 00:00 作者:中国标准物质网 阅读量:463

一、体外影响肿瘤细胞生长实验

(一)染料排斥试验法

根据活细胞在低浓度染液中不着色的特点,用0.4%锥虫蓝或0.1%伊红染料进行。当药物导致细胞死亡时,细胞膜通透性增加,致使染液容易通过细胞膜。加药后计算着色细胞数以示药效。以0.4%锥虫蓝为例,具体实验方法如下。

【材料】

1.4%锥虫蓝储备液 称取4g锥虫蓝,加少量蒸馏水研磨,加双蒸水至l00ml,用滤纸过滤,4℃保存。使用时,用PBS稀释至0.4%。

2.玻璃吸管、血细胞计数板、显微镜。

【方法】

1.制备单个细胞悬液,细胞密度大约在106/ml。

2.染色 取9滴细胞悬液移入小试管中,加1滴0.4%锥虫蓝溶液,混匀。

3.计数 在3分钟内,用血细胞计数板分别计数活细胞(无色透亮细胞)和死细胞(蓝染细胞)。

【结果】

镜下观察,死细胞被染成淡蓝色,而活细胞不被染色。

根据下式求活细胞率,活细胞率在85%以上时,才可将制备的细胞悬液进行接种培养。活细胞率在80%以下时,接种后很难培养成功。

活细胞率(%)=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)x100%

【注意事项】

用锥虫蓝染细胞时,时间不宜过长。否则,部分活细胞也会被染色,从而干扰计数。

(二)生长曲线测定法

肿瘤细胞在最适条件下呈指数生长,以培养时间为横轴,细胞数的对数为纵轴,在半对数坐标纸上描绘出该肿瘤细胞的生长曲线。生长曲线虽然最为常用,但其反映数值不够精确。标准的肿瘤细胞生长曲线近似S形,一般在传代后第一天细胞数有所减少,经过几天的滞留期后,进入对数生长期。达到平台期后生长稳定呈水平直线趋势。

(三)集落形成试验法

集落形成试验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一,其基本原理是单个细胞在体外持续分裂增殖6次以上,其后代所组成的细胞群体,称为集落或克隆。一般情况下,每个集落可含有50个以上的细胞,大小在0.3~1.Omm3之间。通过计数克隆形成率,可对单个细胞的增殖潜力做定量分析。

具体方法就是将肿瘤细胞按不同的密度梯度接种于平皿或者软琼脂上,当发现肉眼可见的集落时,终止培养,镜下计数含有50个以上的细胞集落数,然后求得集落数占接种细胞数的百分比,就得出集落形成率的值。

(四)MTT比色试验法

四唑盐[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT]比色试验是一种检测细胞存活和生长的方法。化学名3-(4,5)-2唑塞-(2,5)-二苯基溴化四氮唑蓝,商品名是噻唑蓝,简称为MTT。检测原理为活细胞中脱氢酶能使MTT还原为不溶性的蓝紫色产物一甲臜(formazan ),并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲臜,用酶标仪测定其OD值,可间接反映活细胞数量。MTT法简单快速、准确,近年成为广泛应用于测定细胞活力的基本方法。

方法为将肿瘤细胞接种于96孔板中,培养一段时间后,加入MTT染色液,继续培养4~6小时,弃去原液后加入DMSO,振荡溶解蓝紫色产物后,用酶标仪检测OD值,记录结果,得出肿瘤细胞活力值。实验过程中注意避免血清干扰,实验要设空白对照,即不加细胞只加培养液的空白对照孔。最后比色时,以空白孔调零。

(五)细胞DNA合成测定法

DNA是细胞遗传的基本物质,其结构中包含4种碱基,胸腺嘧啶核苷(TdR)是DNA特有的碱基,亦是DNA合成的必需物质。因此,用核素3H标记TdR即3H-TdR作为DNA合成的前体掺入DNA合成代谢过程,通过测定细胞的放射性强度,可以反映细胞DNA的代谢及细胞增殖的情况。

主要过程是将肿瘤细胞接种于24孔板中培养至对数生长期时,加入3H-TdR继续培养1~24小时,然后用NaOH裂解细胞,收集细胞裂解液后用液体闪烁仪测定核素放射强度。注意实验用核素具有放射损伤,需严格按放射性实验操作规程进行。

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